实验一 植物基因组 DNA快速制备及其检测

一、 目的： 了解和掌握植物基因组DNA快速制备技术以及对DNA

的琼脂糖凝胶电泳检测技术。

二、 原理：新鲜植物材料在液氮下研磨或有缓冲液存在情况下研

磨，破碎细胞释放其基因组DNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化胺）是一种

去污剂，可溶解细胞摸，在高离子环境下和核酸形成复合物并可溶解，而样

品中蛋白和多糖（酸性粘多糖）则沉淀，由此将核酸和蛋白以及多糖分开。

分离得到核酸，再经过氯仿－异戊醇抽提进一步除去蛋白质，最后可以得到

较高质量的核酸。这种方法获得的DNA样品可用于基因的PCR扩增、分子

标记扩增以及分子杂交实验。

三、 材料试剂和仪器设备

1. 植物材料：新鲜植物材料（叶片、茎段等）

2. 化学试剂：２ＸCTAB提取缓冲液（100mM Tris-Cl, 1.4M NaCl, 20mM

EDTA, 2% CTAB）, 乙醇，氯仿，异戊醇，饱和酚，无菌双重蒸馏水。

氯仿/异戊醇配成24/1。

3. 仪器设备：台式离心机、恒温水浴、电泳设备，凝胶成像系统

四、 实验方法

1. 取新鲜叶片，清洗干净，用滤纸吸干水分

2. 用1.5ml带盖离心管取叶片（一个小圆片），在管内研磨破碎细胞

3. 加入600ul 2XCTAB提取缓冲液，涡旋混匀

4. 65℃水浴1小时，期间每隔20分钟反转摇匀一次

5. 加入等体积氯仿-异戊醇（或等体积酚仿异戊醇）颠倒混匀

6. 6500rpm离心30分钟，取上清液至新的离心管内

7. 可重复5，6步骤

8. 上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇沉淀 DNA（-20℃静置 20 分钟或更长

或过夜）

9. 12000rpm离心5分钟，去上请

10. 75%乙醇清洗DNA，2-3次

11. 风干后加入100ul无菌双重蒸馏水溶解DNA

12. 准备1%琼脂糖凝胶（30分钟凝胶固化）

13. DNA电泳（电压设置为５ｖ／ｃｍ，电泳４０～６０分钟）

14. 紫外检测

15. 记录

五、 结果分析：根据凝胶结果进行分析

六、 思考题

1. 植物基因组制备过程中应该特别注意什么？

2. DNA凝胶电泳原理

七、 参考书

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验二 PCR扩增制备目的基因

一、目的要求

1． 学会PCR仪的使用方法。2． 掌握目的基因的PCR扩增基本操作技术。3． 学

会PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测法。

二、基本原理

PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火

和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的目的靶

DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，

两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在

Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3¡端为合成的起点，以单核苷酸为原料，

沿模板以 5’→3’方向延伸，合成 DNA新链。这样，每一双链的 DNA模板，

经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如

此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循

环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍， PCR产物得以2n

的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，

实际上一般可达106～107倍。

三、实验材料

1．器材 PCR 仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外检测仪、超净工作台、台式离心

机、冰箱、灭菌锅、微量移液取样器、移液器吸头、0.2ml PCR微量管、双面微

量离心管架等。实验前把0.2ml PCR微量管装入铝制饭盒高温灭菌、移液器吸头

装入相应的吸头盒高温灭菌。2． 试剂 2U/ul Taq DNA聚合酶， 10XPCR缓冲液，

10mM dNTPs ， 引物 （ 上游 5-CAAGTCGAACGGTAGCAG-3 ； 下游

5-CTTCGTCACCCTCTGTATG-3）、模板 DNA（1200bp），无菌 dd H2O 、TBE

电泳缓冲液, Gold view核酸染料，加样缓冲液。

四、操作步骤

1．在0.2ml PCR 微量离心管中配制25ul反应体系

dd H2O 18.5ul

10XPCR 缓冲液 2.5ul

10mM dNTPs 0.5ul（每种dNTP终浓度0.2mM）

10¦M引物 各1ul

模板质粒 1ul

Taq酶 0.5ul（1U） 总体积 25ul 离心数

秒即可上机循环。

2． PCR反应程序： (1)． 94℃ 5min （预变性） (2)．94℃ 30s (3)．60

℃ 30s (4)． 72℃ 1min30s 35 个循环（②-④） (5)． 72℃ 10min 4

℃保存。

3．PCR结束后，取10¦l产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要

产物带。

五、思考题

1．复性温度如何确定？ 2．为什么要在最后延伸 10min？ 3．是否有非特异性

扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验三 从琼脂糖凝胶中回收目的 DNA片段

一、 目的要求

学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。

二、基本原理

PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，按分子量大小被分开，排列在凝胶

中，跟 DNAMarker 分子量的对比下，找到目的 DNA 带所在的凝胶，并把它切

下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀

或过柱即可获得目的DNA片段。

三、实验材料

1．器材 紫外检测仪、电子天平，恒温水浴锅，台式离心机，快速混匀器，冰箱，

灭菌锅、微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，

水漂，刀片，一次性手套等。实验前把1.5ml微量离心管装入铝制饭盒高温灭菌、

移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌。

2．试剂 DNA 分子量标准，DNA 快速纯化/回收试剂盒（100 次）（500bp 以上

片段，回收率90%以上），无水乙醇。

四、操作步骤

1．切胶 电泳结束后，把凝胶 EB 染色 10～20min，在紫外灯下找到目的 DNA

带，并用刀片切下胶中 DNA 产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至

一个称量过得1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

2．从凝胶中回收目的 DNA 片段（按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作）

(1)．鼎国DNA快速纯化/回收试剂盒（100次）组成成分： ①．离心柱 100个

柱上含有树脂 ②．溶液 A 100ml 6M NaClO4,0.03M NaAc，pH5.2,少量酚

红 ③．溶液 B 1.5ml 3M NaAc ④．溶液C 60ml 用时加入70ml无

水乙醇,充分混匀 ⑤．溶液D 6ml TE缓冲液

(2)步骤： ①．切取含DNA片段的琼脂糖（100mg～300mg）用吸头捣碎按重量

比1：3（切取重量：溶液A的体积比）加入溶液 A。 ②．65℃水溶5-10分钟，

胶完全溶化即可，其间可振荡助溶 2-3 次，待溶化后置室温加入 15ul 溶液 B,充

分混匀。注：如果体积大于500¦l,可适当增加溶胶时间。 ③．将溶液置于离心柱

中， 静置2分钟， ≥8000rpm 离心20-30秒， 若一次加不完， 可分两次离心。④． 倒

掉液体，加入500¦l溶液 C于离心柱中8000rpm离心 20-30秒，弃液体。 ⑤．重

复步骤4。⑥． 12000rpm再次离心1分钟， 甩干剩余液体以除去残余酒精。⑦． 将

离心柱置于新的离心管中， 室温敞开离心管盖放置5～10分钟， 使乙醇挥发殆尽。

⑧．加入20～30ul溶液D（50℃水浴），静置 2分钟。 ⑨．15000rpm离心1分

钟，管底溶液即为所需DNA。 将DNA贮存于-20℃可长期保存。

【注意事项】： 1．电泳缓冲液可为 TAE 或 TBE，但 TAE 效果最佳。 2．影响

回收率和回收质量最主要因素是 PH 值和切胶薄厚。 溶液 A 为橙黄色，有利于

观察琼脂糖是否完全溶解，也是 pH 指示剂。用户回收时当总体积大于 500ul可

适量多加溶液B；切胶越薄越好。 3．离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，

亦没有关系，可敞开盖离心。 4．水浴温度范围为 50～65℃亦可，溶液 D 的用

量视用户对DNA浓度要求而定。 5．收质量可用OD260/280比值来判断，本试

剂盒所得 DNA 比值大于 1.4，比值偏低主要是一些无机离子的存在，不影响其

他分子生物学操作，国内同类产品及一些低档进口产品 OD260/280 比值一般在

1.1～1.4 之间。

五、思考题

用EB染色和用紫外灯照射目的DNA会不会影响回收结果？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验五 第 II类限制性内切酶及其使用

一、目的：了解和掌握第II类限制性内切酶及其使用方法

二、原理：第II类核酸限制性内切酶可以在DNA分子上特异识别并在识别位点

特异切割DNA分子。许多第II类限制性内切酶在酶量过大或切割反应时间过长

以及缓冲液不合适时会引起星点活性（star activity），使用时应特别注意。

三、材料试剂和设备

λ-DNA，Hind III, 缓冲液M，37℃恒温设备，电泳设备，灭菌的离心管等，冰

盒

四、实验方法

1. 酶切体系准备：ddH2O + 10Xbuffer+λ-DNA 1ug + HindIII 1U, 总体积为

50ul。混匀，离心。

2. 酶切反应条件：37℃ 2~3小时（或过夜）

3. 凝胶准备（可提前准备），30分钟固化

4. 电泳检测：1小时

5. 紫外检测，记录。

五、实验结果： 根据实验结果进行分析

六、 标准： λ-DNA-Hind III 标准酶切后可得到8条谱带： 23130bp, 9416bp, 6557bp,

4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp。

七 思考题

1. 限制性内切酶有几大类，特点是什么？

2. HindIII的缓冲液中不应该存在什么离子？

3. 使用限制性内切酶时应特别注意什么？

一、 参考文献

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验六 目的基因片段与载体连接

一、 目的要求

学会目的DNA片段与载体的体外连接技术。

二、基本原理

DNA连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA 片段仅靠在一起的3‵羟基末

段与5‵磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接，如果是两个或两个

以上不同的双链 DNA 片段连接，则产生重组 DNA 分子。在 Mg2+和 ATP 存在

下， T4DNA连接酶即可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接 （本实验），

也能催化双链DNA片段平末端之间的连接。 TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物都

带有一个3‵－A（目的DNA）与pUCm-T载体在T4DNA连接酶的作用下形成

一种新的重组分子。

三、实验材料

1．器材 超净工作台，台式离心机，恒温摇床，冰箱，微量移液取样器，移液器

吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架等。实验前把0.2ml 微量离心管装

入铝制饭盒高温灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌。

2．试剂 pUCm-T 载体，目的DNA片段，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液

等。

四、操作步骤

取一个灭菌的0.2ml微量管， 按下列次序加入(pUCm-T Vector 使用说明书操

作) l．1ulLigation Buffer (10X) 2．50ng (1.5ul) 的pUCm-T载体 3．6.5ul 纯化

的 PCR 产物(0.2pmol 的 PCR 产物, 通常状况没有必要对 PCR 产物进行定量)

4．1ul T4 DNA Ligase（4U/vl） 总体积10ul 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，

然后置于 16C 恒温培养箱中保温过夜。连接后的产物可以立即用来转化感受

态细胞或置4C 冰箱备用。

五、思考题

l．连接酶的最适温度是多少？ 2．为什么要采用16C 下连接。

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验七 细菌转化

一、目的要求

学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。

二、基本原理

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性

状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技

术。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于感受态细

胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基

上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得

到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

三、实验材料

1．器材 快速混匀器，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，台式离心机，超净工作

台，恒温培养箱，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量

离心管架，培养皿（90mm），酒精灯，玻璃涂棒，小镊子，无菌牙签，摇菌管等。

2．试剂 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），X-gal（5-溴-4-3 吲哚基β-D 半

乳糖苷）， 无菌dd water，胰化蛋白胨20g SOC培养基成分(1L) 酵母提取物

5g NaCl 0.5g 在 950ml 去

离子水中加入以上药品之后，摇动容器使溶液完全溶解。用5M NaOH 调pH值

至7.0。高温灭菌20min后冷至60℃或60℃以下，加入20ml除菌的1M 葡萄糖

溶液（90ml水＋18g葡萄糖，完全溶解后定容至100ml，用0.22¦m滤器过滤除菌

四、操作步骤

1．事先将恒温水浴的温度调到42℃。 2

2．转化 (1)．新鲜制备的或-70℃下保存的 100ml 感受态细胞，置于冰上，完全

解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。 (2)．加入 2ml 连接液，轻轻混匀。 (3)．冰上

放置30分钟。 (4)．42℃水浴热激60秒。 (5)．冰上放置2分钟。 (6)．加400ml

SOC 培养基，37℃ 200-250rpm振荡培养 1 小时。 (7)．室温下 4000rpm离心 5

分钟，用枪头吸掉400 ml上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。

五、思考题

影响转化效率的因素有哪些？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验八 重组子的筛选

一、目的要求

学会篮白斑筛选法筛选重组子的技术。

二、基本原理

具有完整乳糖操纵子的大肠杆菌体能转译β－半乳糖苷酶（Z）、透过酶（Y）

和乙酰基转移酶（A），当培养基中存在诱导物 IPTG和X-gal时，可产生蓝色沉

淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入β－半乳糖苷酶基因（LacZ）

部分缺失的片段（LacZ‵），则重组DNA分子转化LacZ‵互补型菌株，会在含

有IPTG和X-gal的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而LacZ‵互补型菌株，

由于不能转译出有功能的β－半乳糖苷酶，在含有 IPTG 和 X-gal的培养基中得

到的转化子是白色菌落。因此，可以根据菌落篮白颜色的不同，筛选出真正需要

的转化子。即很多载体都携带一段细菌的 lacZ 基因，它编码β－半乳糖苷酶 N-

端的 146 个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的 C-端肽链。当载体

与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的

底物X-gal 变为篮色化合物，这就是所谓的α－互补。而重组子由于基因插入使

α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细

菌为无色菌落或噬菌斑。

三、实验材料

1．器材 恒温摇床，超净工作台，恒温培养箱，灭菌锅，微量移液取样器，移

液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，酒精灯，小镊子，无菌牙签，

摇菌管等。 2．试剂 LB培养基（加氨苄青霉素），无菌dd water， 氨

苄青霉素储存液：无菌水配制5mg/ml，分装后-20C 保存。

四、操作步骤

1．将细菌（从实验七得到）涂布在90mm LB 平板中，平板在使用前预先用20ml

100mM IPTG和100ml 20mg/ml X-gal 涂布。 注：细菌的用量依连接的效率及感

受态细胞的感受率而进行适当的调整。

2．平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

3．观察转化产物的涂布平板和培养后的结果。

4．配制LB（含50g/mL 氨苄青霉素）的培养基及高温灭菌。

5．在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50g/mL 氨苄青霉

素），用记号笔写好编号。

6．在超净工作台中将 70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙

签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛

有 3mL LB（含 50g/mL 氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取 3 个白色菌

落，分别装入3个摇菌管中。

7．37℃摇菌过夜。

五、思考题

1．如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释

这种现象？ 2．白色菌落出现的原理是什么？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验九 转基因植物外源基因 PCR检测方法（特异扩增 PCR）

一、目的：学习和掌握转基因植物外源基因的PCR检测方法。

二、原理：利用PCR原理，通过转基因植物中外源基因序列设计一对特异引物，

以转基因植物基因组DNA为模板，扩增外源基因片段，检测外源DNA。

三、材料方法设备

植物材料：转基因７４１杨，内含有Ｃｒｙ１ＡＣ基因（使用的载体为pBtiA）

试剂： ２ＸCTAB提取缓冲液， 电泳缓冲液， PCR扩增试剂， 特异引物 （Ｐ１ ａ

ｎｄ Ｐ２）

设备：PCR扩增仪，电泳仪，恒温水浴，台式告诉离心机，凝胶成像系统

四、实验方法

1. 转基因741杨基因组 DNA制备 （参考实验一， 但65℃水浴20分钟）（1~2

小时）

2. 1%琼脂糖凝胶电泳检测（20分钟）

3. PCR特异扩增外源基因反应体系25ul: 10Xbuffer, 0.12mmol/L primer1 and

primer2, o.12mmol/L dNTA, 2U Taq enzyme, 20ng DNA

4. PCR反应程序： 95℃ 5’, 94℃ 45’’+ 55℃ 40’’+ 72℃ 50’’(35

cycles), 72℃ 10’,TR保存。（2~3小时）

5. 1%琼脂糖凝胶电泳检测（1小时）

五、实验结果：根据凝胶结果进行分析

六、思考题

1. 植物基因转化的方法有哪些？

2. 随机扩增和特异扩增PCR有什么不同？

七、参考文献

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992