植物生理学实验指导

河北农业大学林学院林业生物技术研究室

2012 年 12 月

目 录

前 言······························································································································1

植物生理学实验守则····································································································2

实验一 植物组织水势的测定（小液流法）····································································4

实验二 叶绿体色素的提取、分离及理化性质························································6

实验三 叶绿体色素的定量测定················································································9

实验四 逆境胁迫对植物细胞膜透性的影响（电导法）········································11

实验五 过氧化物酶活性的测定（比色法）····························································13

实验六 植物组织中丙二醛含量的测定····································································15

实验七硝酸还原酶活性的测定（比色法）································································17

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1 前 言

近几年来，随着植物生理学学科的迅猛发展，教学内容更新较快。植物生

理学是农林各专业的重要专业基础课，植物生理学实验是学生深入理解、掌握

理论知识和提高学生动手能力的重要途径。为了提高教学水平，反映出本学科

更具科学性、先进性和实用性的实验内容，根据教学大纲的要求和课程设置，

同时根据本校教学实验条件，在参阅中外相关文献，学习兄弟院校的教学经验

和资料的基础上，编写了本实验讲义。

本书为本校林学院和园林学院相关专业植物生理学实验指导书，同时可作

为其他相关专业学生参考。书中引用了其他作者部分内容，在此致以诚挚的谢

意。

编者

2012.12

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2 植物生理学实验守则

实验是学习植物生理学的重要方面，本实验指导所列实验都是植物生理学的最基本内容。因此，要求

学习本课程的同学能熟悉这些实验的原理与方法，熟练掌握基本操作技术，以便今后在工作中运用。

一、实验的进行程序和要求

1．预习 学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基

本原理和操作方法有一定的了解。

2．讲解 教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立

操作与观察。

3．在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。

4．示教 每次的实验都备有示教内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间

内获得更多感性知识的机会。

二、实验报告的撰写

做完实验后，每位同学在课后都要独立完成实验报告。实验报告必须强调科学性，实事求是地记录、

分析、综合。一份好的实验报告的主要特点是：整洁、阐述清楚而简洁、结果详尽，讨论及结论符合实验

的实际。

在实验报告中，应当包括下列内容：

1、实验题目

2、实验目的：清楚扼要地阐述本实验所要说明的问题。

3、实验方法

4、实验结果：详细记录所得数据和计算步骤，必要时须将结果列成表格。有些实验则需要描述观察

到的现象。

5、讨论与结论：简要概括所得到的结论，如有可能并与讲授内容加以比较。

三、实验室规则和注意事项

1．实验室必须保持清洁整齐，这是进行实验的必要条件，实验台务必清洁，仪器药品的放置要有次序，

随时取用，随时放回原处，试剂药品不要洒在桌面或地面上，实验完毕应将仪器洗净，并将仪器试剂瓶排

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3 列整齐，擦净桌面，才能离开实验室。

2．使用的玻璃仪器必须洁净。一般玻璃器皿，可用去污粉刷洗，然后用自来水与蒸馏水冲洗干净。

3．实验时产生的废液可倒入水槽中，放水冲走，强酸强碱需先用水稀释，然后倒入废液缸中，勿倒入水

槽，以免腐蚀水管。固体废物如滤纸、残渣及植物材料等须放入废物篓中，不得倒入水槽。

4．实验室内的烘箱、恒温箱、冰箱、离心机、分析天平、分光度计等贵重仪器须在老师的指导下使用，

不得随便拨弄旋钮和开关等。

5．取用试剂或标准溶液，用毕后须立即将瓶塞盖严，放回原处，自瓶中取出的试剂如未用尽，切勿倒回

瓶内，以免掺混。

6．进行试验时必须注意节约，不要用过量药品和试剂，不要浪费滤纸、水、电、蒸馏水，不要损坏仪器。

遇有损坏仪器时须立即报告老师并登记在仪器损坏登记薄中。

7．在实验室务必注意安全，不得在实验室吸烟、吃食和会客，使用自来水勿开过大，用毕关好龙头。在

电炉和酒精灯附近勿放置易燃物品，必须注意防火。

8．实验结束后，值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

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4 实验一 植物组织水势的测定（小液流法）

一、实验原理

当把植物组织或细胞放在溶液中时，两者便会发生水分交换。如果植物组织（或细胞）的水势

低于溶液的水势（即渗透势），组织（或细胞）则吸水，使外溶液浓度增大，比重也增大；反之则

因植物组织（或细胞）失水而使溶液的浓度变小，比重亦变小；如果植物组织（或细胞）的水势与

溶液的渗透势相等，二者则保持水分平衡，此时溶液的比重不变。若把浸过组织的溶液慢慢滴回到

同一浓度而未浸过组织或细胞的溶液中，小液滴则会向上、向下或静止移动。如果小液流停止不动，

则说明溶液的浓度未有发生改变，该溶液的浓度即为所测组织（或细胞）的等渗浓度，溶液的渗透

势（水势）即等于所测组织（或细胞）的水势。通过公式（ψs = -iCRT）计算出溶液的渗透势便

可得出组织（或细胞）的水势。

二、材料、仪器与试剂

1．材料：杨树叶片

2．仪器与用具：移液器、指形管(带橡胶塞)6 支、带盖的青霉素小瓶 6 个、打孔器、橡胶垫、

毛细滴管、解剖针、镊子、试管架。

3．试剂：1 mol·Kg -1 蔗糖溶液、甲烯蓝（又称次甲基蓝）结晶。

三、实验步骤

1．吸取 1 M 蔗糖溶液 1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml 分别放入 6 个指形管中，加入蒸馏

水至 10 ml，盖上橡胶塞后上下颠倒混匀，这样就得到 0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M、0.6 M

的蔗糖溶液。

2．在相应的青霉素小瓶中分别加入上述某种浓度的蔗糖溶液 1 ml，立即盖上塞子，并编号注

明。

3．选择有代表性的新鲜叶片 8~10 片，用打孔器（直径为 0.8 cm 左右）打下小圆片。在每个

青霉素小瓶中，随机地放入 8~10 个边缘整齐的小圆片，盖上盖后，摇动小瓶，使小圆片都能浸入

到溶液中，放置 20 min，此期间摇动小瓶数次，使组织和溶液间充分发生水分交换。

4．20 min 后，用解剖针尖蘸取少许甲烯蓝粉末，分别放入各青霉素小瓶中，摇匀（使各小瓶

中的溶液均呈蓝色，深浅一致），按照浓度从低到高的顺序依次分别用毛细吸管吸取蓝色溶液，轻

轻插入相应的指形管中部，小心并缓慢低放入蓝色溶液一小滴，轻轻抽出毛细滴管（勿搅混溶液），

观察并记录液滴的升降变化情况，从中找出小液滴静止不动的溶液，该溶液的浓度即为叶片组织的

等渗浓度。

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5 小液流法测定组织水势记录表

记载液滴移动方向的符号

“↓” ：下降； “↑” ：上升； “←→” ：静止不动。

四、结果计算

根据 ψw = ψs = -iCRT 计算组织水势（MPa）

式中：ψs—溶液的渗透势，以 MPa 为单位；

R＝0.008314 MPa·L·mol -1 ·K -1 ；

T—绝对温度，即 273+ t ℃；

C—溶液的摩尔浓度，以 mol·Kg -1 为单位；

i－溶液的等渗系数，蔗糖 = 1。

五、注意事项

1．配制糖液浓度要准确，并充分摇匀。

2．取样时选材要一致。

3．打孔时要迅速并避开大叶脉。

4．加甲烯蓝要适量，过多会影响溶液浓度，过少则很难识别小液流移动方向。 液 滴 移 动 方 向

植物

材料 温度

（℃） 0.1 M 0.2 M 0.3 M 0.4 M 0.5 M 0.6 M 等渗浓

度（M） 组织水势

（Mpa）

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6 实验二 叶绿体色素的提取、分离及理化性质

第一部分 叶绿体色素的提取、分离

一、实验原理

叶绿体中的叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素、叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这

些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮、甲醇和石油醚等有机溶剂提取。

叶绿体色素提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。 薄层层析色谱法是将吸附剂均匀涂在玻璃

板上成一薄层。把待分离的样品溶液点在薄层板的下端并把薄层板下端浸入展开剂中后，展开剂通

过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品在吸附剂和展开剂之

间不断地吸附脱附。由于吸附剂对样品中不同成分的吸附能力不同，从而使各组分有不同的移动速

度而彼此分离。

二、材料、仪器与试剂

1．材料：新鲜的菠菜叶片。

2．仪器与用具：天平，移液器，研钵，漏斗，三角瓶，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，

滤纸。

3．试剂：95%乙醇，CaCO3 粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7：5：1，体积比） 。

三、实验步骤

（一）色素提取液的制备

1．取新鲜叶片 4～5 片（2g 左右），洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。

2．研钵中加入少量 CaCO3，加 2～3 ml 95%的乙醇，研磨至糊状，再加 15ml 95%的乙醇，上

清液用漏斗过滤，残渣再用 10 ml 95% 的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色

素提取液。提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其它相关实验。

（二）叶绿体色素的分离

1． 取硅胶预制板一个， 用点样毛细管吸取上述提取液， 平行于硅胶板的短边， 距下边缘 1cm 处

用毛细管划线，风干或吹风机吹干后再划第二次，重复操作 3～4 次。

2．在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约 0.5 cm，将硅胶预制板带有色素的一端放入，

使其下端浸入展开剂中。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，

并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的色带。

当各种色素得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并

迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

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7 四、结果与分析

1、 观察并记录各色素的种类、 颜色和位置。 各色素带的位置可用相对比移值 Rf 来表示。 Rf = 斑

点中心到原点的距离/溶剂前沿至原点的距离。

2、请分析影响色素分离的因素有哪些？

第二部分 叶绿体色素的理化性质

一、实验原理

叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯， 故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿

醇及叶绿酸盐，产生的盐仍为绿色，能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分离。叶绿素吸收

光量子后转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时可发射出红光量子，因而

产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快，

而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被 H + 所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜

则成为很稳定的铜代叶绿素，在强光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

二、材料、仪器与试剂

1．材料：新鲜菠菜叶片

2．仪器与用具：刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，移液器。

3．试剂：95%乙醇（体积分数） ，苯，醋酸铜粉末，5%稀盐酸（质量分数） ，醋酸-醋酸铜溶液，

20%氢氧化钾-甲醇溶液。

三、实验步骤

（一）光对叶绿素的破坏作用

1．取 2 支小试管，各加入 2.5 ml 叶绿体色素乙醇提取液，并用 95%乙醇稀释 1 倍。其中 1 支

放在阳光下，另外 1 支放到暗处或用锡箔纸包严，40 min 后对比观察颜色有何变化。

2．另取之前得到的薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用黑色纸或塑料薄

膜包住，放在直射日光下，30 min 后比较色谱版上的各色素的颜色有何变化。

（二）皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

1．取 1 支 10 ml 刻度试管加入 3 ml 浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入 1ml 20%氢氧化钾-甲醇

溶液，充分摇匀。

2．片刻后，加入 3 ml 苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入 1 ml 蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），

然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，

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8 直到溶液开始分层时，静置，观察颜色变化。

（三）H + 和Cu 2+ 对叶绿素分子中Mg 2+ 的取代作用

1．取两只试管，第一支试管加叶绿体色素提取液 5 ml，作为对照。第二支试管加叶绿体色素

提取液 5 ml 之后，再加入 5% HCl 数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋

酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管比较。

2．取新鲜植物叶片两片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，

随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再发生变化为止。

（四）荧光现象的观察

取一只小试管加入 3 ml 浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下照射，比较溶液在透射光与

反射光下的颜色有何不同。

四、实验结果

观察、记录各个实验所产生的现象，并解释原因。

附注：

1．醋酸-醋酸铜溶液的配制：用 50%醋酸 100ml 溶入醋酸铜 6g，再加蒸馏水 4 倍稀释而成。

2．20%氢氧化钾-甲醇溶液的配制：称 20g 氢氧化钾溶于 100ml 甲醇溶液中，过滤后盛于塞有橡皮

塞的试剂瓶中。

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9 实验三 叶绿体色素的定量测定

一、实验原理

叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。因此，应用分光光度计在某

一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取

的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。

叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。在 80％丙酮溶液中，叶绿素 a 和 b 及类胡萝

卜素在红光区的最大吸收峰分别为 663nm、646nm 和 470nm，而在 95％乙醇溶液中的最大吸收峰

则分别为 665nm、649nm 和 470nm。据此所测得的吸光度值代入不同的经验公式（见实验结果部

分），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡

萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出不同色素的含量。

二、材料、仪器与试剂

1．材料：杨树叶粉

2．仪器与用具：分光光度计，天平，研钵，剪刀，玻棒，25ml 棕色容量瓶，漏斗，滤纸，吸水纸，

滴管。

3．试剂： 提取液（95%乙醇或 80%丙酮），石英砂，碳酸钙粉。

三、实验步骤

（一）叶绿体色素的提取

1．称取 60 mg 杨树叶粉，在研钵中加少许 CaCO3 和石英砂及 1～2 ml 提取液，将组织研成匀浆。

再加提取液 10 ml，静置 3～5 min，至组织变白。

2．将滤纸置于漏斗中，用提取液湿润，沿玻棒把色素溶液倒入漏斗中，过滤到 25ml 容量瓶中，用少

量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

3．用滴管吸取提取液，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。

最后用提取液定容至25 ml，摇匀。

（二）光密度的测定

将色素溶液倒入比色杯内。以提取液为空白，在特定波长下测定色素溶液的光密度。如果提取

液为 80%丙酮，则在 663nm、646nm 和 470nm 波长下测定光密度。若提取液为 95%乙醇，则选择

665nm、649nm 和 470nm 为测定波长。

四、实验结果

1、叶绿体色素的浓度

依据下列 80%丙酮（或 95%乙醇）色素溶液中色素浓度的计算公式，分别计算出叶绿素 a、b

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10

×

×

1000

色素浓度（C）提取液体

积

样品鲜重（或干重） 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。

80％丙酮色素溶液中色素浓度的计算公式：

Ca = 12.21D663 – 2.81D646

Cb = 20.13D646 – 5.03D663

CT = 20.29D646 + 8.05D663

Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229

式中：Ca、Cb 分别为叶绿素 a 和 b 的浓度（mg/L）；Cx·C 为类胡萝卜素的总浓度（mg/L）；D663、

D646 和 D470 分别为色素溶液在波长 663nm、646nm和 470nm下的光密度。

95%乙醇提取液中色素浓度的计算公式：

Ca = 13.95D665 – 6.88D649

Cb = 24.96D649 – 7.32D665

CT =17.64D649 + 6.63D665

Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245

2、叶绿体色素的含量

植物组织中单位鲜重（或干重）各色素的含量 (mg · g -1 )按下式计算：

叶绿体色素的含量 =

五、注意事项

1．为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。

2．叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710nm 或 750nm 波长下测量光密度，其值应小于当波长

为叶绿素 a 吸收峰时光密度值的 5%，否则应重新过滤。

3．用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸

收峰波长相差 1nm，则叶绿素 a 的测定误差为 2%，叶绿素 b 为 19%，使用前必须对分光光度计的

波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。

六、思考题

1．叶绿素 a、b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a、b 的定量分析？

为什么？

2．为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？

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11 实验四 逆境胁迫对植物细胞膜透性的影响（电导法）

一、实验原理

植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植

物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜的透性增加，

选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗，将植物组织浸入去离子水中，水的电导将因电解质的外渗

而加大，伤害愈重，外渗愈多，电导率愈大。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、植物

品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植

物抗性生理研究中。本实验采用电导率法测定电解质的相对外渗率，来了解胁迫情况下植物受害的

程度。

二、材料与仪器

1．材料：杨树叶片

2．仪器与用具：电导仪，打孔器，真空干燥器，恒温水浴锅，真空干燥器，真空泵，试管，

移液器，剪刀，镊子，蒸馏水

三、实验步骤

1．选取植株上相同部位的叶片，用纱布擦干净，分别进行如下处理：（1）放入冰箱（-10℃）

中，冷冻 30 min（低温处理）；（2）放入 60℃烘箱中 20 min（高温处理）；（3）在室内萎蔫 1 hr（干

旱处理） 。以植株上不作任何处理的叶片为对照。

2．用镊子取出处理材料，用蒸馏水冲洗二次，再用干净吸水纸吸去表面的水，用打孔器打下

叶圆片。

3． 取 4 支试管分别编号， 在每只试管中放入某种处理的叶圆片 20 个， 加入 15 ml 蒸馏水后, 放

入真空干燥器内抽真空 10 min，再向干燥器中慢慢放入空气，使水分渗入叶片内。

4．取出试管后静置 30 min，期间摇动几次，便于细胞内的离子外渗。30 min 后分别测定各处

理叶片的电导率。另用不加叶片的蒸馏水作为空白测定。

5．测过电导率之后，将试管再放入 100℃沸水浴中 10min，以杀死植物组织，取出放入自来水

冷却 10 min，测其煮沸电导率。

四、实验结果

1．相对电导度的计算

相对电导度的大小表示细胞膜受伤害的程度，可按下式计算：

相对电导度（L）=（S1-空白电导率）/（S2 -空白电导率）

式中：S1—煮前的电导率

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12

100 1  



CK CK t

L L L S2—煮后的电导率

空白电导率—蒸馏水的电导率

2．伤害度的计算

由于室温对照也有少量电解质外渗， 所以相对电导度并不能完全表示逆境胁迫对细胞膜的伤害

程度，其伤害程度的大小往往用伤害度（或伤害性外渗）来表示，可按下式计算：

伤害度（%）=

式中：Lt —处理叶片的相对电导度

LCK —对照叶片的相对电导度

3．将实验结果记入下表

五、思考题

1．植物在逆境情况下细胞膜的透性会怎样变化？

2．植物抗逆性与细胞膜透性有何关系?

六、注意事项

1. 整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净（全部器皿要洗净），也不要用手直接接触叶片，

以免污染。

2. 测定电导率前，试管内的溶液一定要摇匀。

3．每次往待测液中插入电极时，都要首先用蒸馏水冲洗电极，并用干净吸水纸轻轻拭干。 处理 煮前电导率

（μS/cm） 煮后电导率

（μS/cm） 相对电导度 伤害度

（%） 备注

低温

高温

干旱

对照 空白电导率

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13 实验五 过氧化物酶活性的测定（比色法）

一、实验原理

过氧化物酶（peroxidase，POD，EC 1.11.1.7）是以铁卟啉为辅基的氧化酶，催化 H2O2 氧化某些酚类、

芳香胺和抗坏血酸等还原性物质。它广泛分布于生物界，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，如清

除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白以及促进植物细胞木质素的形成等，与植物的抗寒、抗病能力关

系密切。

在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化，生成红棕色的

四邻甲氧基连酚，该物质在 470 nm 处有最大吸收，因此可用分光光度计测量 470 nm 处的光密度值

表示生成物的含量，继而求出该酶的活性。

过氧化氢与愈创木酚的反应机理

二、材料、仪器与试剂

1．材料：杨树叶片

2．仪器与用具：天平，分光光度计，离心机，秒表，移液器，研钵

3．试剂：0.2 M磷酸缓冲液（pH 6.0），0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5），反应混合液（0.2 M 磷酸

缓冲液（pH 6.0）50 ml，H2O2 0.028 ml，愈创木酚 0.019 ml）。

三、实验步骤

1．称取植物材料 0.5 g，剪碎，放入研钵中，加入 5 ml Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）研磨成匀浆，

以 4000 rpm 离心 15 min，取出上清液，必要时残渣再用 5 ml 缓冲液提取一次，合并两次上清液，

贮于 4℃左右保存备用。

2．取光程 1 cm 的比色杯 2 只，于 1 只比色杯中加入 3 ml 反应混合液和 1 ml 磷酸缓冲液（pH

6.0），混均后作为零校对。于另 1 只中加入 3 ml 反应混合液后，再加入上述酶液 1 ml（如酶活性 4H2O2 4H2O + 4[O]

过氧化物酶

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14

470 ×

× V

T

V

S

tW △OD 过高可稀释之），迅速混匀，同时开启秒表记录时间，于 470 nm 下测量其光密度值（OD470） ，每隔

1 min 读数 1 次，连续测量 5 min。

四、实验结果

1．以时间为横坐标，OD470 值为纵坐标，对所得数据进行线性作图（或用统计方法求回归方程） 。

2．求出图中所作直线（或回归方程）的斜率，即ΔOD470·min -1 ，此为反应的初速度。

3．求出过氧化物酶的活性，以每克植物样品每分钟光密度值的变化来表示。

过氧化物酶活性（ΔOD470·min -1 ·g -1 ）=

式中：

ΔOD470——反应时间内 OD 变化值。

VT ——提取液总体积（mL）。

VS ——测定取用体积（mL）。

W ——植物鲜重（g）。

t ——反应时间（min）。

五、思考题

1．酶活力测定为什么必须测定酶反应的初速度？

2．在本实验的酶提取和酶活力测定时，为什么用不同的缓冲液

附注：

1．0.2 M 磷酸缓冲液（pH 6.0）的配制方法

（1）贮备液：

溶液 A：0.2 M NaH2PO4（27.6 g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成 1000 ml） 。

溶液 B：0.2 M Na2HPO4（53.65 g Na2HPO4·7H2O 或 71.7g Na2HPO4·12H2O 用蒸馏水配成

1000 ml） 。

（2） 0.2M 磷酸缓冲液 （pH 6.0） 的配制： 87.7 ml A 液与 12.3 ml B 液混合后， 用水稀释至 200ml。

2．0.2 M Tris-HCl （pH 8.5）缓冲液的配制方法

（1）贮备液：

溶液 A：0.2 M 三羟基氨基甲烷（24.2 g 三羟基氨基甲烷用水稀释至 200ml）。

溶液 A：0.2 M HCl。

（2）Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）的配制：50 ml A 液与 14.3 ml B 液混合后，用水稀释至 200 ml。

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15 实验六 植物组织中丙二醛含量的测定

一、实验原理

植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化

的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA：Malondialdehyde）

是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定 MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系

统受损程度以及植物的抗逆性。

丙二醛在高温及酸性环境下可与 2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物 3,5,5´-三甲

基恶唑 2,4-二酮（三甲川），该物质在 532 nm 处有一吸收高峰，并且在 600nm 处有较小光吸收。根

据其 532 nm 的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。醛、可溶性糖对此反应有干扰，在 450 nm 处

有一吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。

二、材料、仪器与试剂

1．材料：杨树叶片

2．仪器与用具：离心机，分光光度计，天平，恒温水浴，研钵，试管，移液器，试管架，移液管架，

剪刀。

3．试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。

三、实验步骤

1. 丙二醛的提取：称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片 0.5 g，加入少量石英砂和

10％三氯乙酸 2 ml， 研磨至匀浆， 再加 8 ml10％三氯乙酸进一步研磨， 匀浆以 4000 rpm 离心 10 min，

其上清液为丙二醛提取液。

2. 显色反应及测定：取 4 支干净试管，编号，3 支为样品管（三个重复），各加入提取液 2 ml，

对照管加蒸馏水 2 ml，然后各管再加入 2 ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反

应 15 min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在 532、600 和 450nm 波长下测定吸光度（A）值。

四、实验结果

按下式计算样品中 MDA含量

式中：D450—在 450nm波长下测得的吸光度值

D532—在 532nm波长下测得的吸光度值

D600—在 600nm波长下测得的吸光度值

Vt：提取液总体积（mL）；

 

 

-1 t

532600450 V MDAmmolgFW=6.452DD0.559D

VW

s   





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16 Vs：测定用提取液体积（ml）；

FW：样品鲜重（g）。

五、注意事项

1．可溶性糖与 TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在 450 nm），当植物处于干旱、

高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。

2． 低浓度的铁离子能增强 MDA与 TBA的显色反应， 当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+ （最

终浓度为 0.5 nmol · L-1）

3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。

六、思考题

不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化不同，说明了什么？

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17 实验七 硝酸还原酶活性的测定（比色法）

一、实验原理

硝酸还原酸是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收各利用氮肥有关。它作用于 NO - 3 使还原为

NO - 2；产生的 NO - 2 可以从级织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO - 2 含量的增加，

即表现该酶活性的大小。

在酸性溶液中磺胺与 NO - 2 形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大则

增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重

氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。

二、材料、仪器与试剂

材料：大叶黄杨叶片

仪器与用具：721 型分光光度计，真空泵（或注射器） ，保温箱，天平，真空干燥器

钻孔器，三角烧瓶，移液器，烧杯。

试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5；0.2mol/L KNO3：溶解 20.22gKNO3 于 1 000ml 蒸馏水中；磺胺试

剂：1g磺胺加 25ml 浓盐酸，用蒸馏水稀释至 100ml；α-萘胺试剂：0.2gα-萘胺溶于含 1ml 浓盐酸的蒸馏

水中，稀释至 100ml；NaNO2 标准溶液：1g NaNO2 用蒸馏水溶角成 1 000ml。然后吸取 5ml，再加蒸馏水

稀释成 1 000ml，此溶液每 ml 含有 NaNO2 10μg，用时稀释之。

三、实验步骤

1．绘制标准曲线

吸取不同浓度的 NaNO2 溶液（例如 5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml 于试管中，加入磺胺试剂 2 ml

及α-萘胺试剂 2ml，混合摇匀，静置 30 分钟（或于一定温度的水浴中保温 30 分钟），立即于分光光度计

中进行测定，测定时的波长为 520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2 浓

度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度-浓度曲线。

2．将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约 1cm 的圆片，用蒸馏水洗涤 2

—3 次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约 0.3—0.4g（或每份取50 个圆片），

分别置于含有下列溶液的 50ml 三角烧瓶中：（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+蒸馏水 5ml；（2）

0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空

泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用 20ml 注射器代替，将反应液及叶子圆

片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多

次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于 30℃温箱中，使不见光，保温作用 30 分钟，

然后分别吸取反应溶液 1ml，以测定 NO - 2 含量。

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18 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，

会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入 30μg 3-磷酸甘油醛或 1，6-二磷酸果糖，能显著增加

NO - 2 的产生。

3．NO - 2 含量的测定

保温 30 分钟的结束时，吸取反应溶液 1ml 于一试管中，加入磺胺试剂 2ml 及α-萘胺试剂 2ml，混合

摇匀，静置 30 分钟，用比色计进行比色测定，比色波长为 520nm，记下吸光度或透光率，从标准曲线上

查得 NO - 2 含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO - 2μg或μmol 表示之。