基础生物化学

试验指导书

(林学、生态、园林、林技)

2012.12

试验一 过氧化氢酶活性测定

试验二 氨基酸含量测定

试验三 脯氨酸含量测定

试验四 过氧化物酶活性测定

试验五 蛋白质含量测定

试验六 植物 DNA提取

试验七 琼脂糖凝胶电泳

试验八 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

试验九 植物组织还原糖和总糖含量测定

实验十 维生素 C的定量测定

试验一 过氧化氢酶活性测定

一、目的

过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗

病能力均有关系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握

测定过氧化氢酶活性的原理和方法。

二、原理

过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过

氧化氢量来表示，当酶与底物（H2O2）反应结束后，用碘量法测定未分解的H2O2

量。以钼酸铵作催化剂，使H2O2 与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴

定碘，其反应式为：

H2O2 + 2KI + H2SO4 —→I2 + K2SO4 + 2H2O

I2 + 2Na2S2O3 —→2NaI + Na2S4O6

根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差，即可求出过氧化氢酶分解

H2O2 的量。

三、 材料、仪器、试剂

1. 材料：杨树叶及其他植物叶片。

2. 仪器设备：分析天平；恒温水浴；研钵；100ml容量瓶；100ml三角瓶；

滴定管；滴定管架；移液管；移液管架；漏斗；洗耳球等。

3. 试剂及配制

1.8mol·L －1 H2SO4

10﹪(NH4.)6MO7O4

0.02 mol·L －1 Na2S2O3

20﹪KI

1﹪淀粉液

CaCO3 粉

石英砂

0.018﹪H2O2 溶液配制：吸取30﹪H2O2 原液0.3ml至50ml容量瓶中，加蒸馏

水至刻度，摇匀后再稀释10倍。

四、实验步骤

1. 过氧化氢酶的提取

选取叶片，擦净去主脉剪成碎片，混匀后迅速称取1g放入经冷冻过的研钵

中，加少量CaCO3 粉末及石英砂，并加入3～4ml蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，

用蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过

滤。然后再取滤液10ml至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释

液。

2. 酶活性测定

2.1 取100ml容量瓶4个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml，立即向

3、4号瓶中加入1.8mol·L －1 H2SO4 5ml以终止酶活性，作为空白测定。

2.2 将各瓶放在20℃水浴中保温5～10min（若室温超过20℃则以室温为准）。

保温后向各瓶准确加入 0.018﹪H2O2 5ml, 摇匀并记录酶促反应开始时间。

2.3 将各瓶放在20℃水浴中让酶与底物（H2O2）作用5min。时间到后迅速取出，

立即在1、2号瓶中加入1.8mol·L －1 H2SO4 5ml以终止酶活性。

2.4 向4个瓶中各加入20﹪KI 1ml和3滴10﹪(NH4.)6MO7O4， 摇匀， 用0.02 mol· L

－1 Na2S2O3 滴定至淡黄色后再加入5滴1﹪淀粉液作指示剂，再用0.02 mol·L －1

Na2S2O3 滴定至蓝色刚消失为滴定终点，记录Na2S2O3 用量。

五、酶活性计算

空白与样品两个重复滴定值取平均值按下公式计算出过氧化氢酶活性：

被分解H2O2 （mg）= 〔空白滴定值（ml）－样品滴定值（ml）〕× C × 17.17

被分解H2O2（mg）× 酶液稀释倍数

过氧化氢酶活性（mgH2O2·g －1 Fw·min －1 ）= ——————————————

样品鲜重 （g） ×酶促反应时间 （min）

公式中：C － Na2S2O3 量浓度

17.17 — H2O2 摩尔质量

试验二 氨基酸含量测定

一、 目的

学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法

二、 原理

茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成

紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm

处的光密度，测定氨基酸的含量。

三、材料、仪器、试剂

1标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液。

2pH5.4， 2mol/L醋酸缓冲液： 量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液， 加入14mL 2mol/L

乙酸混合而成。用pH检查校正。

3茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚

溶解。

茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于15～25mL热

蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰

箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，

装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄

色溶液。将5g维生素 C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液

滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷

却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，

备用。

乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加

入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～

125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

460％乙醇。

5样品液：每毫升含0.5～50μg氨基酸。

6分光光度计。

7水浴锅。

四、操作步骤

1．标准曲线的制作

分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试

管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚

三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水

冷却。 放置5min后， 加入3mL 60％乙醇稀释， 充分摇匀， 用分光光度计测定OD570nm。

（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。

以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

2．氨基酸样品的测定

取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，

混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60％

乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。

将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。

五、结果计算

OD570nm 对应标准曲线查得

值 氨基酸含量（mmol/L）=

1 000

试验三 脯氨酸含量测定

一、目的

在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加。

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性， 抗旱性强的品种往往积

累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由

于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固

点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植

物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。通过实验掌握测定脯氨酸含

量的原理和方法。

二、原理

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后

用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲

苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线

上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

三、材料、仪器、试剂

（一）材料

待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。

（二）仪器设备

1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；

6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12.

滤纸；13 剪刀。

（三）试剂

酸性茚三酮溶液：将1.25g 茚三酮溶于30ml 冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸中，

搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。

3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

冰醋酸。

甲苯。

四、实验步骤

1. 标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，

然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100

μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制 取6个50ml 容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，

1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度

分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml 系列标准浓度

的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲

苯溶液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空

白对照，于520nm波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方

程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml 测定液中脯氨酸的含量（μ

g/2ml）。

2. 样品的测定

（1）脯氨酸的提取 准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，

然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过

程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚

三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。

（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在

3000rpm下离心5min。

（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，

在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。

五、结果计算

根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml 测定液中脯氨酸的含量（Xμ

g/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：

单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）＝

100 10 6   



S T

V W V X

式中:X 为从标准曲线查处的2mL 测定液中脯氨酸的含量（ug/2mL); T V 为提取液

体积（mL); S V 为测定是取用的样品体积（mL)；W为样品质量（g)。

试验四 过氧化物酶活性测定

一、目的

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光

合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断

发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。

二、原理

在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物

在470 nm处有最大光吸收值，故可通过测470 nm 下的吸光度变化测定过氧化

物酶的活性。

三、材料、仪器、试剂

马铃薯块茎。

分光光度计，TDL-5000B 型低速冷冻多管离心机(R=18 cm)，研钵，容量瓶，

量筒，试管，吸管。

0.05 mol·L -1 的磷酸缓冲液（pH 5.5），0.05 mol·L -1 愈创木酚溶液，2％

H2O2。

四、步骤

1酶液的制备

取1.0～5.0 g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸

缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3 000×g离心10 min，上

清液转入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容

量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。

2过氧化物酶活性测定

酶活性测定的反应体系：依次加入2.9 mL 0.05 mol·L -1 磷酸缓冲液；1.0 mL

2％ H2O2；

1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚和0.1 mL 酶液。用加热煮沸5 min 的酶

液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3 min，然后迅速稀释

1 倍，470 nm 波长下比色，每隔1 min 记录 1次吸光度A470，共记录5次，然

后以每分钟内A470 变化0.01 为1 个酶活性单位（U）。

五、结果计算

以每分钟内A470 变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）。

△A470 ×VT

过氧化物酶活性(U·g -1 ·min -1 )=──────

W×VS×0.01×t

式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；

W——马铃薯鲜重（g）；

t——反应时间（min）；

VT——提取酶液总体积（mL）；

VS——测定时取用酶液体积（mL）。

六、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，

不能直接加入。

七、问题讨论

简述测定过氧化物酶活性的生理意义。 你知道还有哪些方法可以测定过氧化

物酶活性。

试验五 蛋白质含量测定

一、目的

学习蛋白质含量测定方法

二、原理

1976年由 Bradford 建立的考马斯亮兰法（Bradford 法），是根据蛋白质与

染料相结合的原理设计的。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰

的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究

认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残

基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是：

（1） 灵敏度高， 据估计比Lowry法约高四倍， 其最低蛋白质检测量可达1mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大， 蛋白质－染料复合物有更高

的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5

分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可

以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全

不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、

糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此

Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用

g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton

X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N 的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法

一样） 。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能

用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

三、材料、仪器、试剂

1. 试剂：

（1） 标准蛋白质溶液， 用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)， 配制成1.0mg/ml

和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2） 考马斯亮兰G—250染料试剂： 称100mg考马斯亮兰G—250， 溶于50ml 95%

的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：

（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支

3.材料

杨树叶粉

四、步骤

1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表

中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给各试管

分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到

0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml 考马斯亮兰 G—250试剂，每加完一管，立

即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未

知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

考马斯亮兰法实验表

管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

标准蛋白质

(1.0mg/ml)

0

0.01

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

蒸馏水

0.1

0.09

0.08

0.06

0.04

0.02

0.0

考马斯亮蓝

G－250试剂

5

5

5

5

5

5

5

每管中的蛋

白质量（mg）

0

光吸收值

（A595）

未知蛋白

( 约

1.0mg/ml)

0.04

0.06

0.1

（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品

在595nm处的光吸收值A595， 空白对照为第1号试管， 即0.1mlH2O加5.0mlG—250

试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，

使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙

酮长时间浸泡。

（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，

即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的 A595值，即可查

出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。

2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）

加大到0.5ml 或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml 或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝 G－

250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm 的光吸收值。0.05mg

牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

试验六 植物 DNA提取

一、目的

学习从新鲜的叶片中提取植物总DNA的方法

二、原理

随着植物基因工程的迅速发展， 人们经常需要提取一些适合用限制性内切酶

降解的高分子量植物的DNA(如构建某种植物的基因文库)。本实验介绍的就是一

种快速简便提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，以机械力破

碎细胞壁，然后加人十六烷三甲基溴化铵分离缓种液，使细胞膜破裂，同时将核

酸与植物多糖等杂质分开(十六烷三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium

bromide，简称CTAB，是一种阳离子去污剂)。再经氯仿－异戊醇抽提去除蛋白，

即可得到适合酶切的DNA。

三、材料、仪器、试剂

1．CTAB分离缓冲液

2 ％ w/v CTAB ， 1.4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA,100 mmol/L

Tris-HCl(pH8.0),0.2%V/V巯基乙醇共100mL：称取2g CTAB，8.81g NaCl，0.74g

EDTANa2·2H2O，加入 10mL1mol/L Tris-HCl(Ph8.0),0.2%巯基乙醇，加水定容

至100mL。

2．洗涤缓冲液

76％V/V乙醇，10mmol／L乙酸铵共100 mL：76 mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，

加水至100mL。

新鲜的植物叶片，TE(1mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl(pH7.4))，氯仿—异戊

醇(24：1，V:V)，液氮

3.研钵，恒温水浴（37℃－100℃），离心机，离心管。

4.杨树叶片

四、步骤

(1)将10mI—CTAB分离缓冲液加人30mL 的玻璃离心管中，置于60℃水浴中

预热。

(2)称取1.0－1.5g新鲜叶片，置于预冷的研钵内，倒入液氮．将叶片研碎。

可重复数直至叶片成为很细的粉末，称重。

(3)将叶片粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中， 轻轻转动离心管使之混

匀

(4)样品于60℃保温30min。

(5)加等体积的氯仿—异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀。

(6)室温下4000/min离心8min。

(7)用一开口较大的滴管将上层水相取人另一干净的离心管中，加入 2／3

体积预冷的异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来(有些情况下，在这一步会产生可

以用玻璃棒搅起来的长链DNA， 或者是云雾状的沉淀。 如果观察不到沉淀现象． 样

品则可以在室温下放置数小时甚至过夜)。

(8)用下述方法收集：

●如果呈可见的丝状DNA， 可用玻璃棒搅起， 转移至10—20rnL的洗涤缓冲液中；

●如果 DNA 呈云雾状，可在 2000r／min 离心 1—2min，小心地倒去上清液，在

松散的沉淀物上加10—20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸悬浮起来；

●如果DNA沉淀不可见．则可以在更高转速下离心，但这可能会形成更坚实的沉

淀．并且含有更多的杂质。这种沉淀较难洗涤。加入洗涤缓冲液后，常需要用玻

璃棒搅动．可能将长

链DNA打断。

(9)洗涤至少20min后．4000r／min离心10min，或用玻璃棒搅出沉淀。

(10)小心倒去上溶液，在室温下，使DNA沉淀，空气干燥，称重，计算产率。

(11)将DNA沉淀溶于1mLTE中。

(12)取 15—20uL DNA 溶液〔如有条件，可取同样量的 DNA 溶液做 Hind Ⅲ

酶切或EcoR I酶切)做0.7％的琼脂糖凝胶电泳，以

和Hind Ⅲ酶切的

做分子量标淮，检查DNA的大小和质量。

注意事项

提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段， 所以为保证DNA的完

整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。

五.思考

为保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提及电泳时应注意什么？

试验七 琼脂糖凝胶电泳

一、目的

学习琼脂糖凝胶电泳技术

二、原理

琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术， 可用于分离， 鉴定和纯化DNA

片段。不同大小、不同形状和不同构象的 DNA 分子在相同的电泳条件下(如凝胶

浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。

凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍

此可分析实验结果。

在pH8．0—8．3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大

小和构象的核酸分子电荷密度大致相同(忽略碱基上的部分电荷，每个核苷酸残

基都带二个负电荷)，因此在自由泳动时，各种核酸分于的迁移率相似，无法分

开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分了筛效应，使大小和构象不同的核酸迁

移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分于大小、高

级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度(4℃一30℃之间)无

明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分于量对数及胶浓度成反比，与电

场强度(小于5V／cm)成正比。

在电泳过程中需指示剂指示核酸迁移情况，常用的指示剂是溴酚蓝

(Bromophenol blue，Bb，蓝紫色)和二甲苯蓝(Xylenecyanol，xc，蓝色)。溴酚

蓝的结构式见图 2—11，分子量很小，仅 670，在通常使用的不同浓度胶中电泳

时近似于自由电泳，不存在分于筛效应，所以迁移速度基本相伺。二甲苯蓝结构

式见图2，分于量仅554．6，在不同浓度胶中迁移速度也基本相同。二甲苯蓝带

电荷量与溴酚蓝不同，所以在同一浓度胶中迁移速度比溴酚蓝慢。这两种指示剂

在不同浓度胶中迁移速度与一定长度的核酸分子相当，如在5％的聚丙烯酰胺胶

中，Bb与Xc的迁移速度分别与65核苷酸和260核苷酸相同，在7—8moVL尿素

—5％聚丙烯酰胺中则相当于35和130核苷酸片段。在0．6％、1．0％、2％的

琼脂糖胶中，Bb 的迁移速度大致与 lkb、0．6kb 和 0．15kb 的双链 DNA 片段相

同。因此，按照所耍分离的核酸分子大小，可以根据指示剂迁移情况来决定电泳

时间。

电泳样品中除了加指示剂外； 为了使加样品能沉入胶孔， 还要加入适量蔗糖、

聚蔗糖400或甘油以增加比重。

电泳后的核酸要经过染色才能显示出条带。常用染色剂有溴乙锭

(Ethidiumbromide，EB)吖啶橙(Acridineorange，Ao)。

荧光染料溴乙锭是扁平分子。它可以嵌入核酸双链的碱基对之间，当受紫外

光激发时，发射 590nm 的红色荧光。EB—DNA 复合物的荧光比 EB 本身发射的荧

光强许多倍，因此一般不必洗去背景就可观察到核骏电泳带。如果背景太深条带

不够清晰， 可将胶浸泡于lmmol／L MgSO4中 1 小时或10mmol/L MgCL2中5分钟，

使非核酸结合的 EB 退色。染色一般在电泳结束后进行，将胶浸入 0．5ug／ml

的 EB 水溶液中 10 分钟即可。EB 见光会分解，染色时应避光。染色与电泳同时

进行，只须制胶时将EB加入胶内使浓度达0．5ug／ml，这样可在电泳过程中随

时观察核酸迁移情况。EB 带正电荷，会中和核酸分于的负电荷，同时由于它的

嵌入增加了核酸分于的刚性，所以在含 EB 的胶内电泳，核酸的迁移速度减慢，

如双链线状DNA迁移速度减慢约15％。 因此， 用胶电泳方法测定核酸分子(片段)

大小时，不宜将EB加入胶内，应在电泳后染色。另外，在胶中未结合核酸的EB

向负极泳动，会使样品中各条带染色不均匀，故此法也不宜用于根据荧光强度定

量检测核酸。

在琼脂糖凝胶电泳时，用荧光染料溴乙锭染色，可检测到少至 lng 的 DNA。

单链DNA、RNA分子中若有自身配对的双链区也可被EB分子嵌入，但嵌入量少，

因而检出灵敏度较低，大于0.lug。

三、材料、仪器、试剂

1. 5×TBE：Tris 54 g；硼酸27.5 g；0.5 M EDTA（pH 8.0）20 mL；加双

蒸水至1 L。用时5倍稀释。

2. EB：用水配制成10 mg/mL的贮存液，分装，避光，4 ℃保存（1g溴乙

锭于100mL水中）。

3. 6×加样 buffer： 0.25 %溴酚蓝；40%（W/V）蔗糖；溶于水中，贮存

于4 ℃。

4.DNA标记及DNA样品

四、步骤

1. 胶模 水平放置胶模。

2. 制胶 量取100 mL 1×TBE 缓冲液倒入三角烧瓶中，称取0.8克琼脂糖

加入，在微波炉上加热至全熔（清澈透明）。凝胶加热时间不宜过长，以免蒸干。

3. 倒胶 用琼脂糖封好胶模，待凝胶冷至50℃左右时（手感容器能耐受），

缓缓倒入制胶模中，迅速放好梳子。凝胶的厚度在3～5 mm之间。避免产生气泡，

尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡，可用吸管小心吸去。

4. 凝胶条件 凝胶通常需要在室温中放置20～30分钟。

5. 电泳缓冲液 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中（点样孔在负极），

加入1×TBE电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1 mm。

6. 拔梳子 小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整。

7. 点样 用移液器取 1-2 µL 配制好的 Loading Buffer，分别与需要电泳

的样品或Marker混合(5-10 µL)，点样，记录点样次序。注意：每次电泳每块胶

需留一孔点 DNA marker。加样时 Tip 头不必插入孔中，可对准加样孔，在孔的

上方加样，样品会沉入孔内。

8. 电泳 开启电泳仪电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气

泡比正极多，则表示电泳槽已经接通电源。电泳起始时需采用低压（80～100V），

待电泳几分钟后溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中，可调整电压至 200V 恒压电泳，当

溴芬兰接近胶的先端，停止电泳。

9. 观测 将胶在溴化乙锭（EB）溶液中浸泡约 10 分钟后(如果在胶中已加

入了EB，则不需要浸泡)，在用凝胶成像仪积分成像后观察并拍照。

五、结果

DNA样品琼脂糖凝胶电泳检测图（在自己的点样孔上做上记号）。

六、思考题

1、如果实验成功了，请总结经验；如果实验失败了，请分析原因。

2、谈谈对生物化学实验的看法和改进意见。

试验八 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、目的

熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理和操作方法。 了解聚丙烯酰

胺凝胶电泳分离蛋白质的优点。

二、原理

聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶， 它是由丙烯酰胺(Acr)和交联

剂亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的

脂肪族大分子化合物。聚合反应常用需要过硫酸胺作为催化剂使其聚合。为了加

速聚合，在合成凝胶时通常加入四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂。聚丙烯酰

胺凝胶具有网状立体结构， 且可通过控制Acr 的浓度或Acr与Bis的比例合成不

同孔径的凝胶，以适用于分子大小不同物质的分离，还可以结合解离剂十二烷基

磺酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基的分子量。

根据凝胶各部分缓冲液的种类及 pH 值，孔径大小是否相等，可分为连续系

统和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。在连续系统中，各部分均相同，不

连续系统则不相同。不连续系统的优点在于对样品的浓缩效应好，能在样品分离

前就将样品浓缩成极薄的区带，从而提高分辨率。若样品浓度大，成分简单时，

用连续系统也可得到满意的分离效果。 不连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较

高的分辨率，主要是由于其具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 ．

1．浓缩效应：不连续系统中凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，

下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液 pH6.7，分离胶为小孔径胶，缓冲液

pH8.9。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔

径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中HCl 几乎全部解离为Cl - ，但只有极少

部分甘氨酸解离为H2NCH2COO - 。蛋白质的等电点一般在pH=5左右，在此条件下其

解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其

有效泳动率依次为 Cl - >蛋白质> H2NCH2COO - ，故 C1-称为快离子，而 H2NCH2COO - 称

为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成一离子浓度低的区域即低电

导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯

度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。 在快离子和慢离子之间形成一个稳

定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，

因此蛋白质离子就聚集在快慢离子之间被浓缩成一狭窄带。 这种浓缩效应可使蛋

白质浓缩数百倍。

2．电荷效应：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动

速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电

场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率

不同而形成一条条区带。但在 SDS-PAGE 电泳中，由于 SDS 这种阴离子表面活性

剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远

超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；

此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏

了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在

水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不

再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种 SDS-蛋白质复合物在电泳中不

同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。

3．分子筛效应：各种蛋白质分子由于分子大小和构象不同，因而通过一定

孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，表现出不同的泳动率因而被分开。即使蛋白

质所带的净电荷相似，也会由于分子筛效应被分开。

聚丙烯酰胺凝胶很少带有离子的侧基，电渗作用小，对热稳定，机械强度

大，富有弹性，所以是区带电泳的良好介质。利用SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电

泳测分子量，结果准确、重复性好、其分辨率至少在±10％。

三 、材料、仪器、试剂

仪器：电泳仪，垂直板电泳槽，凝胶摄像系统，微波炉，平皿，脱色摇床，

微量加样器，可调式移液器，滴管，吸量管，烧杯。

材料：中分子量蛋白质标准。

试剂

1) 30％丙烯酰胺储存液 (Acr：Bis=29：1)

Acr 29.1g

Bis 0.9 g

dH2O to 100ml 棕色瓶 4℃贮存

2) 10％SDS： SDS l g

dH2O to 10ml

3) 10％过硫酸铵(AP)： AP 1 g

dH2O to 10ml

4) TEMED(四甲基乙二胺)

5) 分离胶缓冲液( 1.5M Tris-C1缓冲液pH8.8)：

Tris 18.17g

dH2O to 80ml

用1M HCl调pH至8.8

dH2O 定容至 100ml

6) 浓缩胶缓冲液 ( 1M Tris-C1 缓冲液 pH6.8)：

Tris 12.1g

dH20 to 80ml

用1M HCl 调pH 至6.8

dH2O 定容至 100ml

7) 2×上样缓冲液：

甘油 2ml

10%SDS 4ml

1M Tris-C1缓冲液(pH6.8) lml

2％溴酚蓝 2ml

1mg/ml DTT 2ml

混匀，分装EP管，4℃冰箱保存。

8) 电泳缓冲液(10×)：

甘氨酸 141.1g

Tris 30g

10%SDS 10g

dH20定容至 1000ml

调节pH至8.3。

9) 固定液： 乙醇 250ml

冰醋酸 50ml

dH20定容至 500ml

10) 染色液： 考马斯亮蓝R—250 250mg

甲醇 45ml

冰醋酸 10ml

dH20 45ml

11) 脱色液： 冰醋酸 80m1

乙醇 250ml

加dH20 至 1000ml

12) 1%琼脂糖凝胶：琼脂糖 1g

dH20 100ml

加热溶解。

四、步骤

1. 安装垂直板电泳装置

2. 制备SDS聚丙烯酰胺凝胶

配制10%分离胶和5%浓缩胶

10% 分离胶(10ml) 5%浓缩胶(4ml)

30%Acr/Bis 3.33ml 30%Acr/Bis 0.66ml

H2O 4.0ml H2O 2.8ml

1.5M Tris-HCL(pH8.8) 2.5ml 1 M Tris-HCL(pH6.8) 0.50ml

10%SDS 100µl 10%SDS 40µl

10%过硫酸铵 100µl 10%过硫酸铵 40µl

TEMED 5µl TEMED 4µl

注：TEMED加入后必须立即灌胶

3. 样品预处理：取 20µl 样品加入 20µl 2×上样缓冲液，置 100℃沸水浴中煮

沸5分钟。

4. 上样：每孔加入20µl样品。

5. 电泳：接通电源，将电压调至 80V。当溴酚蓝进入分离胶后，将电压提高到

150V，电泳至溴酚蓝距离胶底部lcm处，停止电泳。

6. 固定：取下凝胶，置于固定液中，轻轻振摇10分钟，倒去固定液。

7. 染色与脱色：倒入 50～60℃预温的染色液浸没凝胶，染色约 40 分钟。回收

染色液，用清水冲洗凝胶上多余的染色液。倒入脱色液，轻摇2小时左右，期间

换脱色液2～3次。

注意事项

1. 丙烯酰胺具有神经毒性， 可经皮肤、 消化道等吸收， 故操作过程中应注意防护。

2. 蛋白质加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量过大，条带过宽而重

叠。

过硫酸铵最好当天配置，冰箱贮存最好不能超过一周。

五、思考题

1. SDS-PAGE电泳是如何除去电荷效应的？

2. 2如何通过SDS-PAGE电泳确定未知蛋白的分子量

试验九 植物组织还原糖和总糖含量测定

一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理， 学习比色法测定还原糖的操作方法和分

光光度计的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。 还原糖是指含有自由醛基或酮基的

糖类， 单糖都是还原糖， 双糖和多糖不一定是还原糖， 如乳糖和麦芽糖是还原糖，

蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和

多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还

原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖

含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被

还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物

质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，

查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单

糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、材料、仪器、试剂

1．实验材料 杨树叶粉

2．主要仪器

（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL

×2

（4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL

×1；2 mL×2；10 mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗 （10）

天平 （11）分光光度计

3． 试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸

馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰

箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶

解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g

丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。

（3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。

（5） 6 M HCl和6 M NaOH 各100 mL。（分别取59.19 mL 37%浓盐酸和24

克NaOH定容至100mL）

四、步骤

1. 制作葡萄糖标准曲线

取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖

标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应

液。

表1 葡萄糖标准曲线制作

管 号 1mg/mL葡萄糖标准

液（mL） 蒸馏水

（mL） DNS（mL） 葡萄糖含

量（mg） 光密度值

（OD540nm）

0 0 2 1.5 0

1 0.2 1.8 1.5 0.2

2 0.4 1.6 1.5 0.4

3 0.6 1.4 1.5 0.6

4 0.8 1.2 1.5 0.8

5 1.0 1.0 1.5 1.0

6 1.2 0.8 1.5 1.2

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，

用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540 nm，用0

号管调零点，等后面7~10号管准备好后，测出1～6号管的光密度值。以光密度

值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

葡萄糖标准曲线

2. 样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取

准确称取3.00 g叶粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然

后加入50 mL蒸馏水，搅匀，置于50 ℃恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使

还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻

度，即为还原糖提取液。

（2）总糖的水解和提取

葡萄糖含量（mg）

光密度值

准确称取1.00 g叶粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸馏水及10 mL 6

M HCl，置沸水浴中加热水解30 min, 取出1～2滴置于白瓷板上，加1 滴I-KI

溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后

加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100

mL，过滤取滤液10 mL 于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000

倍的总糖水解液，用于总糖测定。

（3）显色和比色

取4支20 mL具塞刻度试管，编号，按表 2所示分别加入待测液和显色剂，

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏

水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，

用0号管调零点，测出7～10号管的光密度值。

表2 样品还原糖测定

管

号 还原糖待

测液（mL） 总糖待

测液

（mL） 蒸馏水

（mL） DNS

（mL） 光密度值

（OD540nm） 查曲线葡

萄糖量

（mg） 平均值

7 0.5 1.5 1.5

8 0.5 1.5 1.5

9 1 1 1.5

10 1 1 1.5

五、结果与计算

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10 管光密度值的平均值，在标准

曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数， 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分

含量(以葡萄糖计)。

提取液总体积 查曲线所得葡萄糖毫克数

× 测定时取用体积

还原糖（%）=

样品毫克数 ×100 =

注意

1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比

色。

2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

六、思考题 查曲线所得水解后葡萄糖毫克数×稀释倍

数 总糖（%）=

样品毫克数 ×0.9×100 =

1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要

用NaOH中和？

2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时

设0号管有什么意义？

3. 绘制标准曲线的目的是什么？

实验十 维生素 C的定量测定

（2,6-二氯酚靛酚滴定法）

一、目的

1.学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。

2.了解水果中维生素C含量情况。

二、原理

维生素c是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此

又称为抗坏血酸(ascorbic acid)。它对物质代谢的调节具有重要的作用．近年

来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有对化学致癌物的阻断作用。

维生素C是具有 L系糖构型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布

很广，植物的绿色部分及许多水果(如橘子、苹果、葡萄、山楂等)、蔬菜(黄瓜、

洋白菜、西红柿等)中的含量更为丰富。

维生素 C 具有很强的还原性。它可分为还原型和脱氢型。金属铜和酶(抗坏

血酸氧化酶)可以催化维生素 C 氧化为脱氢型。根据它具有的还原性质可测定其

含量。还原型抗坏血酸能还原染料 2，6—二氯酚靛酚（Dichlorophenolindo

pheno1 一 DCPIP)．本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2，6—二氯酚靛酚呈

红色，还原后变为无色。因此．当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维

生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生

素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无

色转变成微红色时即表示溶液中的维生索C刚刚全部被氧化此时即为滴定终点。

如无其他杂质干扰． 样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏

血酸量成正比。

本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2，4—二硝基苯肼法和

荧光分光光度法测定．

三、材料、仪器、试剂

材料

苹果、桔子等。

试剂

1．2％草酸溶液

草酸2g溶于100 mL蒸馏水中。

2．1％草酸溶液

草酸1g溶于100 mL蒸馏水中。

3．标准抗坏血酸溶液

准确称取 10mg 纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用)溶于 1％草

酸溶液中，并稀释至I00 mL贮于棕色瓶中，冷藏．最好临用前配制。

4．0.1％2，6—二氯酚靛酚溶液

250mg 2，6—二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg 碳酸氢钠的热水中，冷却后

加水稀释至250 mL，滤去不溶物，贮于棕色瓶中冷藏(4℃)约可保存一周。每次

临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。

器材

锥形瓶(100mL)，组织捣碎器，吸量管(10 mL)，漏斗，滤纸，微量滴定管（5

mL），容量瓶（100 mL，250 mL）

四、步骤

1提取

水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果．用纱布或吸水纸吸干表面水分。然

后称取50－100加入等体积2％草酸，置组织捣碎机中打成浆状，滤纸过滤，滤

液备用。滤饼可用少量2％草酸洗几次，合并滤液，记录滤液总体积。

2标准液滴定

准确吸取标准抗坏血酸溶液 1.0 mL (含 0.1mg 抗坏血酸)置 100 mL 维形瓶

中，加9 mL 1％草酸，用微量滴定管以0.1％2，6—二氯酚靛酚滴定至谈红色，

并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫

克抗坏血酸(取10 mL l％草酸作空白对照，按以上方法滴定)。

3样品滴定

准确吸取滤液两份，每份10.0mL分别放人2 个100 mL锥形瓶内，滴定方法

同前。另取10 mL l％草酸作空白对照滴定。

五、计算

注意事项

(1)某些水果、蔬菜(如橘子、西红柿)浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。

(2)整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过

2min。滴定所用的染料不应小于 1 mL 或多于 4mL，如果样品含维生素 C 太高或

太低时酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。

(3)本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下干扰物质反应进行很慢。

(4)2％草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1％草酸无此作用。

(5)干扰滴定因素有：

●若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加l mL

氯仿，到达终点时．氯仿层呈现淡红色。

●亚铁离子可还原二氯酚靛酚，对含大量亚铁离子的样品可用8％乙酸溶液代替

草酸溶液提取，此时亚铁离子不会很快与染料起作用。

●样品中可能有其他杂质还原二氰酚锭酚，但反应速度均较抗坏血酸慢．因而滴

定开始时染料要迅速加人，而后尽可能一滴一滴地加人，并要不断地摇动三角瓶

直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。

(6)提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。

六、思考题

1. 为了测得准确的维生素C含量，实验过程中应注意哪些操作步骤？为什么、

2. 试简述维生素C的生理意义。