《木本植物组织培养》（实验）教学大纲

与实验指导书

课程名称：木本植物组织培养

学时学分：实验 16 学时

先修课程：植物学、植物生理学、基础生物化学、遗传学等。

适用专业：林学

一、性质和任务：

植物离体培养是生物技术的基础和重要内容， 它为研究植物细胞组织的生长

分化及形态建成规律创造了有利条件，有力地推动了生物科学中植物生理学、生

物化学、遗传学、细胞学、形态学以及农林、医药方面等各门学科的发展和相互

渗透，促进了营养生理、细胞生理和代谢、生物合成及基因重组的研究。近20

年来，建立在植物离体培养技术基础之上的植物的快速繁殖与脱毒、种质保存、

次生物质生产、细胞工程和基因工程等技术成果已纷纷进入了实用阶段。本课程

为林学专业的选修课。木本植物植物组织培养实验课的开设，有利于学生掌握植

物组织培养的基础理论和操作技能，为学生进一步从事细胞工程、基因工程研究

奠定了基础，也为部分学生的就业开辟了新途径。

二、教学目的及要求：

1．掌握植物组织培养及工厂化育苗体系的设计，掌握培养基的制备、材料

的接种，无菌培养和移栽技术。

2．掌握利用不同外植体材料，如：茎尖、叶片、种胚等，达到不同目的所

采取的特殊操作技术。

实验内容与学时分配：

实验一、参观植物组织培养实验室 (1学时)

主要内容：掌握植物组织培养实验室的设计要求和主要仪器设备。

实验类型：验证实验

实验二、培养基母液和培养基的配制 (3学时)

主要内容：掌握培养基母液和培养基的配制及高压灭菌技术。

实验类型：验证实验

实验三、木本植物茎尖培养快速繁殖技术（3学时）

主要内容： 要求学生掌握植物快速繁殖的程序和操作方法， 包括外植体消毒、

接种、继代培养及污染原因的分析及控制方法。

实验类型：验证实验

实验四、胚培养技术 (3学时)

主要内容：要求学生能进行幼胚的培养，掌握胚抢救技术。

实验类型：验证实验

实验五、诱导木本植物器官发生（3学时）

主要内容：以杨树试管苗叶片为外植体诱导器官再生。

实验类型：综合证实验

实验六、试管苗的生根与移栽（3学时）

主要内容：炼苗、整畦、搭拱棚、移栽、维护和管理。

实验类型：综合实验

实验七、木本植物组织培养综合大实验（16学时）

内容提要：按照实验室教学资源，将选修本门课程的同学分成若干个兴趣小

组，老师要求每个兴趣小组完成一份有关植物组织培养的研究计划，该计划必须

是在参考相关文献的基础上完成的。待老师对上述研究计划进行审核，经同学们

修改后即可实施，实施过程同样是在老师指导下由兴趣小组独立自主的完成。

注：该实验与上述其它六个实验为平行关系，学生可自由选择。

实验一 植物组织培养实验室设计

目的要求：掌握植物组织培养实验室的设计要求和主要仪器设备。

实验内容：以参观林学院组培室结合查阅相关文献为主。

实验室设计是由工作的目的和规模决定的，要合理布局，通常按自然工作程

序先后安排成一条连续的生产线， 避免有的环节倒排增加日后工作的负担或引起

混乱。房屋可规划为洗涤室、灭菌室、培养基制备室、无菌操作室、培养室、移

栽驯化室。

1 准备室

需备有的设备有：干燥箱、落水架、工作台、水池、水盆、试管刷等，主要

用于玻璃器皿、用具和培养材料清洗；还需要有高压水龙头用于冲洗。

2 灭菌室

需备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤器、用于培养基及培养器械的灭菌。

3 培养基制备室

需备有冰箱、化学实验台、药品柜、器械柜、物品存放架以及各种玻璃器皿

和用具，包括各种不同容积的容量瓶、烧杯、量筒、移液管、移液器、三角瓶、

各种类型培养瓶、玻璃棒、电磁炉、微波炉等。

4 无菌操作室(接种室)

无菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，是植物组织培

养研究或生产工作中最关键的部分，关系到培养材料的污染，工作效率等重要指

标。一般要求:

(1)地面、天花板及四壁尽可能光洁、避免积染灰尘，易于采取各种清洁措

施。

(2)干爽、安静、清洁明亮，在适当的位置吊装紫外灯1-2盏，用以经常照射

灭菌，使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态。

(3)最好安置一小型空调机，使室内温度保持在 26℃左右，这样就可以在工

作时或不工作时都把工作室的门窗紧闭，保持与外界相对隔绝的状态，尽量减少

与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入。

(4)经常采用消毒措施，达到较高的无菌水平，以利完全操作提高工作的质

量与效率。

(5)无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋洗手及处理外界采

回准备消毒培养的材料等。

无菌操作室应备有超净工作台、移动式载物台、酒精灯、干燥灭菌器、器械

支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等。

5 培养室

应尽量安排在楼层较高处，以利于采光，减少尘埃和杂菌污染的机会。此外

应考虑清洁、干燥，培养室保温隔热。培养室中距离窗户较远处的培养架应适当

安装人工辅助照明的日光灯。应设计能有效通风的窗户、定期或需要时加强通风

散热，如在室内地板稍高处设置进风气窗，在气窗的对侧近天花板设置排风窗，

也可安装小功率的排风扇。

室内应备有制冷设备、加热设备、控光设备、固定式培养架、旋转式培养架、

摇床等。

6 鉴定室

需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、解剖镜、恒温箱、切片机、

烤片台、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。

7 驯化移植室

应备有温室、喷水装置、荫棚、移植床、钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗

沙等，用于试管小植株的锻炼和移植。

实验二、培养基母液和培养基的配制 (3学时)

一、实验目的与意义

学习和掌握培养基母液与培养基配制及灭菌方法。

对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不

同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成

功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢

产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。 培养基的主要成分包括无机营

养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。在配制培养基前，为了使用方便和

用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比

培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量

吸取母液即可。

二、实验器材

电光分析天平（感量为 0.0001g）、扭力天平（感量为 0.01g）、台秤

（感量 0.5g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100

ml、50 ml、25 ml）、细口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、药

勺、玻璃棒、PH计、电磁炉。

三、实验药品

NH4NO3、 KNO3 、CaCl2·2H2O 、 MgSO4·7H2O、KH2PO4 、 KI 、

H3BO3 、 MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、 Na2MoO4·2H2O 、

CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O 、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O 、肌

醇 、烟酸 、盐酸吡哆醇(维生素 B6) 、盐酸硫胺素(维生素 B1) 、甘

氨酸 、蔗糖、琼脂等。

四、实验步骤

（一） 、大量元素母液的配制

各成分按照表 1 培养基浓度含量扩大 10 倍，用感量为 0.01g 的扭力

天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到

1000ml 的容量瓶中，即为 10 倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好

标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配 1L 培养基取此液 100ml。

表 1 MS 培养基大量元素母液制备

序号 药品名称 培养基浓度（mg/L） 扩大 10 称量(mg)

1 NH4NO3 1650 16500

2 KNO3 1900 19000

3 CaCl2·2H2O 440 4400

4 MgSO4·7H2O 370 3700

5 KH2PO4 170 1700 蒸馏水定

容至

1000ml

注意：(1) 配制大量元素母液时，某些无机成分如 Ca2+、SO42 一、

Mg 2 十和 H2PO4 一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避

免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等

级较高的分析纯， 各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解

后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将 Ca2+、SO42 一、

Mg 2 十和 H2PO4 一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。

(2)CaCl2·2H2O 要在最后单独加入，在溶解 CaCl2·2H2O 时，蒸馏水

需加热沸腾，除去水中的 CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O 放入

沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。

２、微量元素母液的配制

MS 培养基的微量元素无机盐由 7 种化合物（除 Fe ）组成。微量元

素用量较少，特别是 CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O ，因此在配制中分

微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表 2，表 3 配方，用感量为 0.0001g 的电光分

析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制 1L 培养基，

取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml

表 2 MS 培养基微量Ⅰ的配制

序号 化合物名称 培养基浓度 （mg/L） 扩大 100 倍称量(mg)

1 MnSO4·4H2O 22.3 2230

2 ZnSO4·7H2O 8.6 860

3 H3BO3 6.2 620

4 KI 0.83 83

5 Na2MoO4·2H2O 025 25

表 3 MS 培养基微量Ⅱ的配制

序号 化合物名称 培养基浓度 （mg/L） 扩大 1000 倍称量(mg)

1 CuSO4·5H2O 0.025 25

2 CoCl2·6H2O 0.025 25

注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，

用吸耳球将天平内的脏物清理干净。

3、铁盐母液的配制

铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配

成母液即可。 目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合

物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不

易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养

基时，配制 1L 取此液 10ml。

表 4 MS 铁盐母液的配制

序号 化合物名称 培养基浓度 （mg/L） 扩大 100 倍称量(mg)

1 Na2-EDTA 37.3 3730

2 FeSO4·7H2O 27.8 2780

注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成 Fe S 04 和

Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04 会结晶析出。为避

免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04 和 Na2EDTA 应分别加热溶

解后混合， 并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 -

30 min)，调 pH值至 5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。

4、有机母液的配制

MS 培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡

哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏

水溶解，注意称量时用电子分析天平。

注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染

的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再

用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生

素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。

表 5 MS 培养基有机物质母液的制备

序

号 化合物

名称 培养基浓

度 （mg/L） 扩大

倍数 称量

(mg) 配制体

积(L)

1 甘氨酸 2 500 100 0.1

2 肌醇 100 200 2000 0.1

3 盐酸硫胺素(VB1) 0.4 1000 40 0.1

4 盐酸吡哆素(VB6) 0.5 1000 50 0.1

5 烟酸 0.5 1000 50 0.1

5、 激素母液配制

植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而

定。一般激素母液的配制的终浓度以 0.5mg/ml 为好，需要注意的是：

（１）配制生长素类，例如 IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量

95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用 1mol/L 的 NaOH 溶解，然后

用蒸馏水定容到一定的浓度。

（２） 细胞分裂素， 例如 KT， 应先用少量 95%乙醇或无水乙醇加 3~4

滴 1mol/L 的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。

（３）配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。

注意：

所有的母液都应保存在 0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能

继续使用。

（二） 培养基配制（以 1L MS 培养基为例）

1、计量

根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公

式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/母液浓度

（mg/L）。

2、移液

取医用瓷缸一只， 按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷

量杯中备用。

注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放

母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即

淘汰这种母液，重新进行配制。

②用量筒或移液管量取培养基母液之前， 必须用所量取的母液将量筒

或移液管润洗 2 次。

③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取 1

种，划掉 1 种，以免出错；

④移液管不能混用。

3、称取

称取 8g琼脂，30g蔗糖备用

4、融化

用搪瓷量杯量取 600～700ml 的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加

热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。

注意：

在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾

的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可

用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧

杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。

5、混合

将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到 1000ml，来回混合

几次。

6、调 pH

用滴管吸取物质的量浓度为 1 mol/L的 NaOH或 HCl溶液， 逐滴滴入

溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的 pH 试纸(5.4～7.0)

测培养基的 pH，一直到培养基的 pH 达到要求为止(在调制时要比目

标 pH值偏高 0.2～0.5 个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物

质的降解，pH 值会下降 0.2～0.5 个单位左右)。

注意：

调至时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。

7、分装

溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后

将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml 或 100 ml)中。注意不要让培养

基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的 1/5～

1/4。每 1L培养基，可分装 25～30 瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨

水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。

注意：

培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基 pH

值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不

凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基 pH值，一般不低于

5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。

（三）培养基的灭菌

培养基中含有大量的有机物质， 特别含糖量较高， 是各种微生物滋生、

繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培

养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植

物组织培养中十分重要的环节。 常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除

菌。

1、高压蒸汽灭菌法

把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽

灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好

锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针

开始移动，当指针移至 0.5kg/cm2 时，扭开放气阀排除冷空气，使压

力表指针回复零位。当指针移至 1.1～1.2kg/cm2 时，即 121℃时，维

持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的

时间也要适当考虑，具体可以参考表 6。灭菌后要趁热取出三角瓶，

不可久不放汽，让压力锅自行冷却，这样易将棉塞等闷得太湿，引起

后来长霉污染。培养基自然冷却凝固。放置 1 d 后再使用。

表 6 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间

容器的体积(ml) 在 121℃下最少灭菌时间(min)

20~50 15

75~150 20

250~500 25

1000 30

1500 35

2000 40

：（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由

于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。

当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时

间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不

到灭菌效果。对蒸馏水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压

力也要提高，一般在 126℃维持一个小时。另外三角瓶中的液体不超

过总体积的 70%，否则当温度超过 100℃时，培养基会喷溢，造成培

养瓶壁和封口膜的污染。

（2）消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置 24-72h。放置后

如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接

种。另外做好的培养基一般应在 1-2 周内用完，短时间可存放于室温

条件，如不能尽快用完，应放在 4℃条件下。

表 7 饱和蒸汽压力与其对应的温度

饱和蒸汽压力

kg/cm 2 磅/平方英寸 温度

℃ 饱和蒸汽压力

kg/cm 2 磅/平方英寸 温度

℃

0.0 0 100 1.055 15 121.0

0.141 2 103.6 1.125 16 122.0

0.281 4 106.9 1.266 18 124.1

0.442 6 109.8 1.406 20 126.0

0.563 8 112.6 1.543 22 127.8

0.703 10 115.2 1.681 24 129.6

0.844 12 117.6 30 134.5

0.984 14 119.9 50 147.6

2、过滤除菌

培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中可能会降解。这类物质需要

进行过滤灭菌。例如一些生长因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和

某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。先将除

去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至 40℃,

再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。 如果是

液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再加入。

除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于 0.4μm。过滤灭菌的原理，是溶液通

过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。滤膜的吸附作用力也不

容忽视， 往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。 在需要过滤灭菌的液体量大时，

常使用抽滤装置。液量少时可用注射过滤器，它由注射器、滤器(可更换)、持着

部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝

箔或牛皮纸等包扎好，最好放在有螺旋盖的玻璃罐中，经高压灭菌，滤器灭菌不

应超过121℃。由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用，在液量多时多用

几套这种装置(亦可适当重复使用)也能顺利完成液体灭菌操作。在使用前按无菌

操作要求将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起， 把吸有需要过滤灭菌溶液的

注射器插入细菌过滤器与之相配合的插接口，推压注射器活塞杆，将溶液压过滤

膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了，但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过。

在一般情况下，人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒。更严格的实验研究

中，这一点仍不容忽视。毫无疑问，过滤过的溶液要按无菌操作要求尽快加入培

养基中，以免重新遭到污染。假如需经过滤灭菌的溶液带有沉淀物，那么在过滤

灭菌之前可用3号烧结玻璃滤器预先予以去除， 这样可以减少细菌滤膜微孔被堵

塞的情况。

五、思考题：

1、 配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl2·2H2O时，为什么要

将蒸馏水加热？

2、 根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各

种母液吸取量，填入下表。

培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。

实验三、木本植物茎尖培养快速繁殖技术

一、实验目的与意义

培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验，领

会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作

技术。

二、实验器材

超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。

三、实验药品及材料

0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水；杨树、刺槐或月季茎尖；培养基母液。

四、实验步骤

（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。

（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，

同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯，

开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。

（3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有 75%酒精的棉球

把手消毒一次。

（4）将外植体在流水下冲洗干净。

（5）将外植体放于200ml的广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水

冲洗，然后用0.1%升汞溶液（加入吐温2滴）浸泡3、5、10min，期间不断摇动

溶液，用无菌水洗涤5遍，剥离茎尖组织待用。

（6）解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有 75%的酒精的棉球

把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用

75%酒精擦洗接种台表面。

（7）接种用的镊子使用前插入 95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上

烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。

（8）在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧

瓶口， 灼烧时应不断转动瓶口 （靠手腕的动作， 使试管口沾染的少量菌得以烧死），

左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却。将剥

离茎尖组织放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放

4-6个外植体。

（9）转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好

绳子，标上接种日期、材料名称、姓名等。

（10）将接种材料移到培养室培养。

注意：

（1）从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛

等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。

（2）外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受

力、 灭菌剂的去除等因素,最好选用两种消毒剂交替浸泡,初次实验灭菌时间要设

置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见表1。

（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打

喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用 75%的酒精擦拭双

手。

（4）接种前培养基出现大量污染现象,若菌类只存在于培养基表面，且主要

是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净，菌类种群密度

过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。另

外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的原因。避免此现象发

生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保

证灭菌时间。

（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀,此种情况主要是接种过

程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人

员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免此现

象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无

菌室用紫外灯灭菌时间不低于 20-30 min；用 75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开

启15-20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭

菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。

（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。

解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-1 5 min，自来水冲洗0 .5-2h后，再

选择适宜的灭菌剂消毒，一般用 0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或

有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，

以提高杀菌效果。

表 1 植物组织培养中常用的消毒剂

消毒剂名称 使用浓度 （%） 消毒难易 灭菌时间（min） 消毒效果

乙醇 70～75 易 0.1～3 好

氯化汞 0.1～0.2 较难 2～15 最好

漂白粉 饱和溶液 易 5～30 很好

次氯酸钙 9～10 易 5～30 很好

次氯酸钠 2 易 5～30 很好

过氧化氢 10～12 最易 5～15 好

五、思考题

1、接种后污染调查

观察接种后2～5天的污染情况，填入下表：

观察日期

接种日期 接种数 污染数 污染率 主要污染菌

种

注：污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％

如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然

没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接

种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒时间适宜。

2、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？有时候会在消毒溶液

中加入1～2滴的表面活性物质，例如吐温80 或吐温20，为什么？

3.在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？

4.对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？

5.观察记录外植体生长分化情况。

实验四、杨树胚培养技术

一、实验目的与意义

学习和掌握胚培养的一般方法。

在远缘杂交中，杂种胚往往是败育的，这时候只有进行幼胚培养才能获得下

一代的种苗，因此幼胚培养在远缘杂交中具有极大的利用价值。另外，幼胚在诱

导基因转化受体、筛选突变体方面也具有重要的应用价值。因此幼胚培养越来越

受到科学家们的关注。幼胚在胚珠中是异养的，需要从母体和胚乳中吸收各类营

养物质与生物活性物质，因此进行幼胚培养时，必须通过培养基向它提供足够的

营养，并提供适宜的培养条件。

二、实验器材

超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀。

三、实验药品

MS培养基各种母液、NAA、6-BA、2，4-D、KT、蔗糖、琼脂。

四、实验步骤

1、培养基的配制

诱导培养基：MS+6-BA0.05mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%。

分化培养基：MS+6-BA0.5mg/L +蔗糖3%+琼脂 0.6%。

生根培养基：1/2MS+NAA 0.2+IAA 0.5+蔗糖3%+琼脂0.6%。

2、取材

杨树花蕾萌动开始时，分别挂牌记录开花时间，10-20d 后，硕果飞絮前，

从田间取回果穗，置于4℃冰箱内处理24h。

3、接种

将果穗用75%的酒精消毒30s，用0.1%升汞消毒8min，用无菌水洗三次，于

无菌条件下将幼胚剥出接在诱导培养基上。

4、培养

接种后的培养瓶于 2000～3000lx 光照，（25±1）℃条件下培养，25d 统计

胚萌发率。

5、分化

将萌发的胚接种到分化培养基上。统计分化率：

6、生根

试管苗长到2～3cm时转到生根培养基。

7、炼苗

打开瓶口，在培养间炼苗2～3d，转到自然条件下炼苗2～3d。

8、移栽

洗去小苗表面的培养基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田。

五、思考题

植物胚胎培养分为哪些类型?各有何特点和要求?胚胎培养有何重要意义?

实验 五 植物叶片诱导器官发生

一、实验原理

分化了的植物根、茎、叶细胞往往具有全能性，有一定条件下进行离体培养，

给于一定的营养与激素，可以脱分化为愈伤组织，经过进一步的分化培养，给于

不同的营养和激素成分，又可以生出完整的小植株。植物的脱分化和分化培养，

证明分化了的植物细胞仍具备形成全整的植株所需要的全套基因。

二、实验目的

1. 用无菌操作方法，把杨树叶片直接诱导培养分化小植株。

三、实验材料

杨树组培苗。

四、实验器具和药品

固体培养基：MS液体加0.6%琼脂

分化培养基：1.MS培养基加 KT(或BA)2毫克/升

2.MS培养基加 KT(或BA)2毫克/升+IAA0.05毫克/升

五、实验步骤

（一）操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，尽量做到不带菌。

（二）完成以上步骤后，又应用70%酒精棉花擦手，以便再行消毒。

（三）在超净工作台上将叶片从组培苗上带叶柄剪下， 然后垂直叶主脉横切4

－5道切口。

（四）由小镊子将剪好的叶片放入盛有脱分化培养基的三角烧瓶中，每瓶放

3-4片，挂上标签，写明日期，组号。

（五）组培室中光下培养3—4星期后观察。

六、实验结果

（一） 观察并记录接种的脱分化培养的组织细胞有无污染？

（二） 愈伤组织细胞是否出现？讨论其来源与影响？

（三） 有无器官发生，形成多少芽？

实验六、试管苗的生根与移栽

一、实验原理

具有不定根的生根试管苗小植株，经过炼苗，可逐渐脱离无菌试管环境，根

系将更多的自主吸收矿质营养，叶片上气孔的发育更加完善，叶片光合能力逐渐

提高，最终完全恢复自主生长能力。生根试管苗从培养基的看护生长逐步过渡到

大田的自主生长。

二、实验目的

掌握影响试管苗大田移栽成活的关键因素和解决办法。

三、实验材料

杨树生根试管苗。

四、实验设施和药品

简易温室、遮阴棚、农用塑料薄膜、沙土、杀菌剂、小花盆若干。

五、实验步骤

1. 对栽培基质沙土进行土壤消毒处理，然后装盆待用。

2. 用镊子轻轻的将生根试管苗从培养瓶中取出，洗净根表面附着培养基并保湿

待用。

3. 将生根试管苗移栽到小花盆中，移栽时注意不要弄伤苗的根茎出，同时保持

不定根伸展，不要窝根。

4. 将移栽好的小苗放在遮阴棚下做好的苗床中，用塑料薄膜以小拱棚的形式覆

盖保湿处理。

5. 完成以上步骤后，进入日常管理，注意将小拱棚内温度控制在 20-25℃，湿

度85%以上。

6. 观察试管苗生长情况，带小苗有新叶长出时，逐渐对小拱棚进行通风处理，

到最后完全移除塑料薄膜。

六、实验结果

观察并记录移栽成活情况，分析影响移栽成活的因素。

实验七、木本植物组织培养综合大实验（16 学时）

1、按照实验室教学资源，将选修本门课程的同学分成若干个兴趣小组。

2、 兴趣小组在指导教师宏观指导下进行选题，保证实验内容的可行性、实验过

程的探索性以及可能实验结果的科学性和创新性。

3、小组成员查找资料、制定研究计划、设计试验方案。

4、 指导教师对研究计划与试验设计方案进行审核，组织同学讨论并修改。

5、 进行试验研究。实验内容包括母液的配置、培养基的制备、培养基的灭菌、

外置体的消毒与接种、 试管苗的继代与培养甚至包括试管苗的生根与移栽等组织

培养的基本技术。在这一过程中，每一步均由兴趣小组组长组织小组全体成员共

同完成。

6、组织同学对实验结果进行调查分析，撰写实验报告进行总结。