林木病害生物防治实验指导

（森林保护专业适用）

河北农业大学林木病理教研室

2012年 12月

前 言

植物病害一直严重地威胁着农业生产， 人类防治植物病害可以追溯到几千年前, 过去使

用的多为植物性或无机化学农药。 20 世纪40 年代初期, 有机合成农药大量产生, 有效地控

制了病害。 但大量使用化学农药，导致抗药性、环境污染和人类健康受到威胁, 即三害( 3R,

Resistance, Residue, Resurgence)。3R 问题的出现引起人们的广泛关注, 于是生物防治

的研究开发应用被提到了议事日程上来, 并得到各国政府的重视。

从植物病害防治的角度来讲, 生物防治就是利用生物及其代谢产物防治植物病害,控制

病原体的方法。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系, 调节有害生物种群密度, 即生

物群防治生物群。 我国植物病理学家陈延熙根据多年的实践和国际上生物防治的方向, 提出

了较符合自然情况的生防概念, 他指出:植物病害的生物防治是在农业生态系统中调节寄主

植物的微生物环境使其利于寄主而不利于病原物或者使其对寄主与病原物的相互作用发生

有利于寄主而不利于病原物的影响, 从而达到防治病害的目的。

用于植物病害防治的微生物种类主要有细菌、真菌、放线菌。这些生防微生物控制植物

病害的机制主要有：1）通过占领病原菌在植物上的侵染位点，与病原物竞争水分、营养而

达到防治病害的目的；2）通过产生代谢产物抑制病原物的生长和代谢；3）通过寄生在病原

菌上，利用病原菌获得营养，从而抑制病原菌的生长；4）诱导植物对病原菌产生系统获得

性抗性，增强植物的抗病性；5）对植物的生长环境进行微生态调控，促进植物生长，增强

其对病害的抵御能力；6）通过多种生防机制对病原菌起协同拮抗作用。

实验一 植物病害生防菌的分离、培养

一、实验原理

生防菌主要有细菌、放线菌和真菌三大类。 植物病害生防菌的分离培养是利用生防菌进

行植物病害生物防治研究和应用的前提。 为了获得生防菌的纯培养，首先必须把目的生防菌

分离出来， 再根据不同生防微生物生长所需营养和环境条件， 使其在平板培养基上形成菌落，

从而获得纯培养物。

二、实验目的

通过本实验学习生防菌的常规分离、培养和纯化技术，学习从菌落及培养特征等方面区

分细菌、放线菌和真菌的类别。

三、实验材料及准备

1. 实验材料：土壤、植物材料

2. 培养基

细菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂NA培养基。牛肉浸膏 3g，蛋白胨5g，葡萄糖 2.5

g，琼脂 15～18 g，蒸馏水 1000 mL。

放线菌分离培养基：高氏 1 号培养基。可溶性淀粉 20 g，K2HPO4 0.5 g，KNO3 1 g，

MgSO4.7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4 0.01 g，琼脂 17～20 g，pH 7.2～7.4。

真菌分离培养基：PDA培养基。去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 10～20 g，琼脂 17～20 g，

蒸馏水 1000 mL。

3. 设备及用具

超净工作台、无菌培养皿、无菌吸管、三角瓶、试管、无菌水、酒精灯、接种环、玻璃

刮环、接种针和记号笔、恒温培养箱等。

四、实验方法及步骤

（一）土壤生防菌的分离和培养

1. 土壤生防菌的分离

土壤稀释平板法是应用最广泛的一种分离和计数土壤中放线菌、 细菌和大量产孢真菌的

方法。

①取经过风干过筛后的土样 10 g，放入盛有 90 mL无菌水的三角瓶中，振荡约 20 min，

使土与水充分混合，将菌分散，制成 10 -1 浓度土壤悬浮液。

②在悬浮液沉降前吸1 mL加入另一盛有 9 mL无菌水的三角瓶中振荡摇匀，即为10 -2

浓度悬浮液。同样方法，逐级稀释成不同的系列悬浮液。

③然后根据土样或所需分离的微生物，取一定稀释度的悬浮液 0.1mL 加在已制好的平

板培养基上，用玻璃刮铲将稀释液在培养基上充分混匀铺平，倒置于 25~30℃恒温箱培养。

④根据不同微生物生长速度不同，分别于 2d，3d，5d观察记载分离结果。

一般认为，每个平板上达到 50~150 个菌落的适当分离稀释度为放线菌 10 -3 ~10 -4 ，细菌

10 -5 ~10 -6 ，真菌 10 -4 ~10 -5 。

分离一般真菌和细菌常用 PDA 培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂 NA 培养基。有时为提高分

离效果，可在 PDA 中加入 1000 mg/kg 链霉素等以抑制细菌生长，或在牛肉膏蛋白胨琼脂

NA培养基中加入五氯硝基苯等以抑制真菌生长。放线菌分离一般采用高氏 1 号培养基。

2. 土壤中生防菌的培养

分离于平板的生防细菌和放线菌，一般可置于 28℃（真菌 25℃左右）下培养，待长出

菌落后，用接种环挑取菌落于平板划线培养，再次形成菌落后，于斜面划线培养，置于 4℃

冰箱保存。 真菌用接种铲取菌落边缘，连同培养基转入斜面培养，产孢后置于 4℃冰箱保存。

（二）植物体表生防菌的分离和培养

1. 生防菌的分离

（1）水洗法

①取叶片 5～10 张，在自来水下冲去浮土，晾干，用打孔器打取直径为 1 cm的圆片。

②取 0.5 g样品置于盛有 l00 mL无菌水的三角瓶内，振荡 20～30 min，即得植物样品的

水洗液。

③在培养基平板表面加入 0.1 mL 水洗液涂匀，置于 25~30℃恒温箱培养，2~5d后取出

检查菌落并计数。

（2）悬浮液稀释平板法

①取叶片 5～10 张，在自来水下冲去浮土，晾干。

②将 1g 样品在无菌研钵中研碎，放入盛有 100 mL 灭菌水的三角瓶中，用磁力搅拌器

振荡约 20 min，即成 10 -2 浓度植物体悬浮液。

③在悬浮液沉降前吸1 mL加入另一盛有 9 mL无菌水的三角瓶中振荡摇匀，并以此逐

级稀释成不同的系列悬浮液。

④根据土样或所需分离的微生物，取一定稀释度的悬浮液 0.1 mL加在已制好的平板培

养基上，用玻璃刮铲将稀释液在培养基上充分混匀铺平，倒置于 25~30℃恒温箱培养。

⑤根据不同微生物生长速度不同，分别于 2d，3d，5d检查菌落并计数。

2. 生防菌的培养

生防菌的培养基、培养、纯化和菌种保存可参照前述土壤生防菌方法。

（三）植物体内生防菌的分离和培养

1. 生防菌的分离

（1）植物内生真菌的分离

①取叶片 5～10 张，冲洗净表面的浮土及附生物。

②剪取 0.5 cm 2 的组织小块，在 75%的乙醇中浸 30～60 s，立即转入 3%的次氯酸钠消毒

液中浸 5 min，再用无菌水洗 3 次，置无菌滤纸上吸干表面水分，然后转入 PDA 培养基平

板上，置于 25℃恒温培养箱培养。

（2）植物内生细菌的分离

①取健康无病植株的根、茎、叶等组织，分别用自来水冲洗干净。随机称取 0.5 g，75%

酒精中振荡浸泡 30~60 s，再用 2%的次氯酸钠溶液振荡浸泡 1~5 min(叶片 1 min，茎 3 min，

根 5 min)，无菌水冲洗4 次。以最后一次清洗的无菌水涂板为对照，据此检验此消毒方法是

否能全部杀死供试材料表面微生物。

②在无菌条件下，将消毒后的组织研磨成匀浆，并梯度稀释涂平板，置于 28℃黑暗培

养 48 h。

2. 生防菌的培养

生防菌的培养基、培养、纯化和菌种保存可参照前述土壤生防菌方法。

五、实验报告

1. 提交 l～2 份生防菌的分离物，并描述其培养性状和形态特征。

2. 分离生防微生物的目的是什么？采用稀释法分离生防菌，如何保证准确并防止污染？

3. 分离生防菌的材料选择有什么原则？

实验二 植物病害生防菌的室内拮抗作用测定

一、实验原理

筛选有效的生防菌是植物病害生物防治成功与否的关键。 植物病害生防菌的防治机制主

要有拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、溶菌作用、捕食作用等。生防菌的室内拮抗作用测

定是利用生防菌进行植物病害防治的基础。

二、实验目的

通过本实验，使学生掌握植物病害生物防治的基本原理及操作方法，明确生防菌拮抗、

竞争、重寄生等作用机制，学会生防菌室内检测的常规技术。

三、实验材料及准备

1. 实验材料

（1）供试生防菌：荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens） 、枯草芽孢杆菌（Bacillus

subtilis） 、木霉菌（Trichoderma spp.）等。

（2）供试靶标致病菌：棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum） 、番茄灰

霉病菌（Botrytis cinerea） 、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）等致病菌。

（3）培养基：PDA培养基、水琼脂培养基。

2. 试剂与器皿

无菌水、无菌玻环、医用玻璃喷雾瓶、培养皿、接种针、比色盘、培养箱、显微镜、玻

璃刮环、载玻片、盖玻片、滤纸、比色盘、打孔器或无菌塑料吸管等。

四、实验方法及步骤

1. 活体微生物抑菌效果的室内测定

（1）琼胶平板竞争作用的测定

生防菌和供试病原菌分别接种在同一琼胶平板表面， 根据两者向前扩展的菌落之间出现

的抑制现象，确定所测菌株的拮抗性。可以按以下方法之一进行接种：

①靠近琼胶平板的边缘，在一边划线接种拮抗菌，另一边平行划线接种病原菌；

②靠近琼胶平板边缘划线接种拮抗菌，与拮抗菌垂直的方向划线接种供试病原菌（T字

形接种）；

③在琼胶平板上距离2～4 cm，一点接种拮抗菌，另一点接种病原菌；

④在琼胶平板中央接种供试病原菌，四周靠近边缘等距离接种多种拮抗菌。

（2）病原真菌重寄生现象观察

①取一灭菌载玻片置于 PDA平板表面；

②用灭菌接种针于水稻纹枯病菌边缘取约 10 mm 2 大小菌落块置于载玻片边缘 20 mm

处；

③自木霉菌落边缘切取约 10 mm 2 大小菌落块，置于载玻片另一端距水稻纹枯病菌 20

mm处，盖上灭菌的盖玻片；

④盖上 PDA平板，封口膜封口后，置于 25～28℃培养箱培养 3~5d，并逐日观察，至木

霉菌和水稻纹枯病菌相接后 48h，取下盖玻片，将其置于另一滴有蒸馏水的另一干净载玻片

上，置于 100和 400 倍显微镜下观察真菌菌丝的形态、直径以及致病菌菌丝被木霉菌寄生的

现象。

（3）抑制靶标致病菌孢子萌发的测定

①用吸管吸取对等靶标菌及生防菌的孢子悬浮液于比色盘中，混合均匀。

②取经 70%酒精消毒的玻璃环，在其上下两端涂凡士林，粘在玻片上，并在环内加入

几滴无菌水。

③取一洁净的盖玻片，在其上滴一滴混匀后的上述菌液，迅速翻转，放于玻片上，使其

形成悬滴置于盖玻片上。

④取一大培养皿，皿内铺等大的无菌滤纸，加入无菌水，放 U 型玻棒，再将做好的玻

片置于其上，于 25℃培养箱中培养。设不加生防菌的处理为对照。

⑤24 h后，在显微镜下观察，统计萌发率。

2. 微生物代谢物的拮抗检测

（1）滤纸片法。即先在培养皿内倒入水琼脂制成平板，再倒入一层带有病原菌孢子的

培养基，将浸有不同浓度培养滤液的灭菌滤纸片移放到平板的四周，25～28℃培养箱培养一

周后检测滤纸片周围抑制圈的有无和大小。

（2）管碟法。与上述方法相同，制备病原菌平板，平板四周等距离放置小不锈钢管，

在每个小钢管内加入不同浓度的生防菌培养滤液，经培养后测量钢管周围的抑菌圈直径。

（3）孢子萌发法。于无菌凹玻片上滴入混有测试病原物孢子液的生防菌培养滤液 0.1～

0.2 mL，在 25～28℃下培养 24 h，检查孢子萌发及芽管情况。

（4）离体叶片测定法。

①将体外活性测定有效的菌株经摇瓶发酵后过滤，滤液加适量乳化剂。

②取生长较一致而无病斑待测植物叶片， 浸没滤液至全部湿润，取出后在阴凉处待药液

干燥。

③用无菌打孔器打取试验菌菌饼，反贴于浸有发酵滤液的叶片上， 以喷清水和化学农药

的叶片作为对照。

④在保湿条件下培养， 待空白对照叶片严重发病， 调查处理叶片的发病情况， 计算药效。

五、实验报告

载玻片 盖玻片

Rs Tv

1. 拍照记录具有拮抗作用、重寄生作用和竞争作用的生防菌照片。

2. 为什么琼脂培养基中测定的拮抗作用结果与土壤中的表现会有不同。

实验三 植物病害生防菌的温室生防效果测定

一、实验原理

田间应用才是植物病害生物防治工作的最终目的， 由于田间的的各种环境条件影响， 室

内抑菌试验结果往往与盆栽试验和大田应用试验的结果不一致， 因此必须将初筛入选的有效

菌株经过多次盆栽试验进一步验证，将具有明显防病效果的菌株进行田间小区试验， 检验其

防病效果与稳定性，同时结合观察供试作物对这些生防菌的反应并探索其应用技术， 才能对

筛选的生防菌应用效果作出准确评价。

二、实验目的

通过本实验学习温室内测定生防菌生防效果的常用方法； 并通过种子发芽或温室盆栽试

验等方法，测定初筛有效生防菌株对植物和病原物的反应。

三、实验材料及准备

1. 实验材料

（1） 供试病原菌 丝核菌 （Rhizoctonia） 、 镰刀菌 （Fusarium） 和灰霉菌 （Botrytis cinerea）

等。

（2）供试生防菌 木霉（Trichoderma spp） 、芽孢杆菌（Bacillaceae），和放线菌及其抗

生素等。

（3）供试作物 黄瓜、番茄、大豆种子和幼苗等。

（4）培养基 PDA培养基、1.5%水琼脂培养基

2. 实验器具

无菌蒸馏水、灭菌培养皿、花盆、三角瓶、烧杯、培养箱等。

四、实验方法及步骤

1. 土壤基质中生防菌防效的测定

（1）土壤试管法

土壤经灭菌处理后，加入一定量的供试拮抗菌如细菌或放线菌悬浮液。保持 7～14 d，

使生防菌定殖，再接种一定量的病原微生物，通过观察病原菌在该土壤中的生长能力，测定

生防菌的效力。

（2）盆栽试验法

将病原菌与含有生防菌的土壤充分混合， 然后播种寄主种子或移栽幼苗。通过受感染的

幼苗生长及感病情况、病原菌的传播距离和速度测定生防菌的效力。

（3）育苗测定法

寄主植物种子接种生防菌后播于天然感病土壤中。 以种子的存活、 植株的活力来测定生

防菌的效力。插穗或移栽苗在种植于感病土壤前，也可用生防菌先接种，然后再定植，以植

株的感病情况及生长情况测定生防菌的效力。

2. 盆栽试验测定法

（1）幼苗盆栽测定

选取生长一致的幼苗，喷生防菌发酵滤液或粗制品，阴干后，把预先在 PDA 琼脂平板

上培养的病原菌菌饼或菌悬液接种在叶片上，以喷清水做对照。在 25～28℃中保湿培养，

调查发病率。

（2）种子盆播测定

适用于种传病害及土传病害。将待测种子经表面消毒后接入待测病原菌，在生防菌发酵

滤液中浸泡 24 h，播种在装有灭菌土的花盆内，以清水处理作对照。于适当温度下培养1~2

周后调查出苗率及根系生长情况。

五、实验报告

1. 观察盆栽试验中生防菌对病原菌的抑制作用，记录叶部病斑率，病苗率和种子萌发

率，计算生防菌的防治效果。

2. 人工接种检验拮抗微生物的防病作用时应注意哪些问题？

实验四 生防菌的发酵与扩繁

一、实验原理

将筛选出的生防微生物进行扩大培养甚至工业化生产是实现其生防效果的必要途径。 发

酵罐的条件控制优于摇瓶是因为其溶氧、pH、温度、泡沫、补料的控制更加精确和到位，

从而使产物的产量更高。发酵生产流程一般是：保藏斜面菌种——活化斜面菌种——摇瓶菌

种——菌种罐——发酵罐。小型实验可以略去菌种罐一步。

二、实验目的

通过本实验使学生学习了解菌种培养基与发酵培养基的区别，了解发酵工业的生产流

程。

三、实验材料及准备

1. 实验材料

（1）菌种：金色产色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes） 。

（2）检测病菌：烟草赤星病菌（Alternaria alternata） 。

（3）培养基：

斜面菌种培养基：麦芽粉 0.5%、玉米粉 0.5%、酵母膏 0.4%、琼脂粉 1.2%，pH 6.3，

121℃灭菌 20 min，之后制成斜面。

母瓶种子培养基：黄豆饼粉 5%、豆油 2%、葡萄糖 1%、KH2PO4 0.1%，pH 6.5，CaCO3

0.3%，121℃灭菌 20 min。

种子培养基：黄豆饼粉 2%、玉米粉 1.5%、葡萄糖 1.0%、酵母粉 0.4%、KH2PO4 0.1%、

NaCl 0.1%、豆油 1%，pH 6.5 左右，CaCO3 0.3%。蒸汽消毒，冷却后按体积的 1%接入母瓶

种子。

发酵培养基：黄豆饼粉 3%、玉米粉2%、麦芽糖液（40%麦芽糖）2%、酵母粉 0.4%、

鱼粉 0.5%、NaCl 0.1%、CaCO3 0.3%、豆油0.5%、pH 6.8 左右。

2. 实验器材

恒温摇床、培养箱、发酵罐、三角瓶、吸管、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、载玻片、

盖玻片等。

四、实验方法及步骤

1. 菌种制备

将金色产色链霉菌菌种接种到斜面菌种培养基上， 26℃培养 14 d，待斜面表面长成丰满

的棕灰色孢子即可使用。斜面保存期不应超过 2个月。

2. 母瓶种子的制备

用斜面菌种培养基上产生的孢子接种母瓶种子培养基，摇床上 28℃培养 36～48 h，培

养液呈浅棕黄色，pH 5.5～6.4，菌丝粗壮有分枝，染色均匀，即可作种子用。

3. 种子的制备

种子培养基经高温灭菌、冷却后按体积的 1%接入母瓶种子。培养温度 28℃，罐压 0.5

kg/cm 2 ，通气量 1:0.4～1:1.0，连续搅拌培养 22～26 h，发酵液 pH 6.5 左右，镜检时菌丝粗

壮，交织成网，分枝短而分节长，染色均匀，即可移种。

4. 发酵

发酵培养基消毒冷却后按体积的 5%接入种子罐，培养温度 28℃，罐压 0.5 kg/cm 2 ，通

气量 1:1，连续搅拌培养。最适发酵 pH 6.5～6.8。在发酵过程中，pH 会不断下降，此时应

通 NH3 以控制 pH。培养至 30 h左右，应不断补料（原料为饴糖和硫铵），并定期检测氨氮、

残糖和 pH，以便及时调整至最佳状态。

5. 放罐

发酵至 120 h左右，总残糖降至 1%以下，pH 和氨氮开始回升，镜检时部分菌丝自溶，

染色很浅，发酵单位不再上升时，应及时放罐提取。

6. 多抗霉素的生物测定

检测菌为烟草赤星病菌。 培养基为 PDA。 标准品为 Polyoxin A （毫克单位 1000 µg／mg）。

标准曲线的制作：将标准品配成 12.5.µg/mL、50 µg/mL、75 µg/mL、100u µg/mL、150

µg/mL、200µg/mL，其中 50～150 µg/mL各浓度与抑菌圈直径在半对数表上呈直线关系。用

上述标准曲线测得， 用于测定标准混合组分样品的含量为 840 µg/mg。 在日常的生物测定中，

使用的标准品为 840 µg/mg交链孢的混合组分样品，以计算待测样品中多抗霉素的含量。

五、实验报告

1. 计算发酵液中所含抗生素的含量或效价。

2. 如何提高菌种的产毒能力。

附：OBF—SF—100L 发酵罐操作规程

一、灭菌准备工作

打开排水阀、放气阀，放尽夹套、加热器内的存水。

取下放料口套，打开放料阀和尾气调节阀，放尽罐内液体。

然后关闭罐体与管路上的所有阀门。

打开蒸汽发生器准备提供蒸汽。

二、空罐灭菌

步骤 操 作 内 容

1 打开系统控制开关（总电源及搅拌空气开关；加热的空气开关不能打开），选择

灭菌辅助程序设置： 灭菌温度一般取值 （110℃～130℃） 间， 灭菌所需时间 （10～

60 min），将搅拌转速设置为 0 rpm，中间温度设置为0℃，进入程序运行。空罐

灭菌时 PH、DO 电极不要装，实罐灭菌时再装。

2 提供蒸汽源，打开蒸汽发生器出汽阀和进蒸汽阀。

3 通过调节进蒸汽阀、进气过滤器出气阀、尾气过滤器出气阀，使罐压保持在

（0.1Mpa～0. 15Mpa）之间，温度保持在（110℃～130℃）之间（具体按工艺需

要）。

4 当罐内温度达到设定的灭菌温度时灭菌倒计时开始，当设定的灭菌时间到时，仪

器鸣叫（按键消除鸣叫），停止蒸汽供应，阀门保持微开状态。

5 打开空压机、调节气体流量计调节阀、打开罐体进气隔膜阀，洁净空气进罐体，

打开尾气阀排气，使罐体保持正压。

6 当罐体降至 60℃以下，打开阀门，放尽罐内冷凝水后，再关闭阀门。罐内保持正

压，空罐灭菌完成。

三、实罐灭菌

步骤 操 作 内 容

1 装上已经校正好的 PH、DO电极，调整好消泡电极、液位电极工艺位置，拧紧其

紧固螺帽。

2 按工艺要求罐内放入培养基。

3 打开系统控制开关（总电源及搅拌空气开关：加热的空气开关不能打开）选择灭

菌辅助程序，设置搅拌转速：l00 rpm、中间温度：90℃；灭菌所需温度：（110

℃~130℃）；灭菌所需时间：(l0 min～60 min)，进入程序运行。灭菌所需温度及

所需时间按工艺要求设置。

4 当罐温达到设置中间温度 90℃时，仪器鸣叫（按键消除鸣叫），此时，搅拌电机

停止运行，继续由蒸汽对罐体加热灭菌。

5 打开夹套阀门放尽夹套内循环水。

6 调节罐压和罐温，按工艺要求保持在 0.l MPa～0.2 Mpa 即 110℃~130℃之间。当

罐温到达 100℃时，空气过滤器排水排气阀门一定要微开，以保证过滤器的有效

灭菌。

7 当罐温达到设定的灭菌温度时，灭菌倒计时开始。当设定的灭菌时间到时，仪器

鸣叫（按消除键消除鸣叫），停止蒸汽供应，关闭相应阀们，相应阀门保持微开

状态。

8 打开空压机、调节气体流量计调节阀、打开罐体进气隔膜阀，洁净空气进罐体，

打开尾气阀排气，使罐体保持正压。

9 将转速、温度参数设置成 AUTO，其他参数都设置成OFF 状态，然后进入 RUN

运行。

10 当罐体降至设定温度时，实罐灭菌完成。

四、接种培养

当各测量参数显示正常且稳定，罐温稳定在设定（接种）温度，就可进行接种工作。

准备合格的菌种液。

灭菌酒精盘内倒入医用无水酒精，点燃就位适当关小尾气阀，使罐压增加，慢慢打开接

种盖，为了防止罐内气体将火焰吹灭，可将酒精盘适当抬高；然后将接种盖放在盛有酒精的

容器中。

将菌种瓶口放在火焰上烧一下，并在火焰下拔下瓶塞，小心而迅速将菌种倒入发酵罐。

盖上接种盖并拧紧，灭火焰，用酒精棉擦洗干净接种口周围。

按工艺要求调节通气量、罐压。

五、培养基与酸、碱、消泡剂添加（补料、换液）

将酸、碱、消泡剂、培养基等放入洗净补料瓶拧紧瓶盖。

夹紧长端出口软胶管（防止灭菌过程掺液）。

把不锈钢插针放入保护套且与胶管补料瓶一起放入高压灭菌锅灭菌 30～45 min后冷却

待用。

将补料瓶的连接胶管与相应的蠕动泵连接就位。

选择补料输液口，取下补料口Φ19 堵头，用酒精棉花沾些无水酒精涂在补料口上点燃，

迅速取出用不锈钢插针插入补料口拧紧。

六、取样

打开蒸汽发生器水源开关，电源开关。

打开蒸汽发生器出汽阀，对取样阀进行灭菌，保持 20～30 min。

取下取样口套，打开取样阀放出少量培养液后，关闭取样阀；用火焰封取样口，把预先

灭菌的取样瓶置于火焰上，拔去瓶塞，瓶口对准取料口，打开取样阀后至所需取样量后即关

闭取样阀；盖上瓶盖；放上取样口套。

取样后需再次对取样口进行灭菌以防污染。

关闭蒸汽发生器水源开关、电源开关、出汽阀。

七、发酵罐的清洁

清洗前应取出 PH、DO 电极按其要求保养。

清洗罐内可配合进水进气、电机搅拌、加温一起进行，如多次换水还不能清洗洁净，则

要打开顶盖用软毛刷刷洗罐内部件。方法如下：

1. 关闭系统控制开关与电源开关，取下顶盖电极、电机及其连线插头。

2. 拧下罐盖紧固螺丝，小心垂直向上取出罐盖横置于平整桌面，垫好，不要碰撞轴和

叶轮，用中性洗涤剂刷洗罐体各部件。

3. 清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。

4. 拧紧罐盖六个紧固螺丝，用力要平衡并注意罐与罐座间隙均衡。

实验五 植物源杀菌剂的筛选及生物活性测定

一、实验原理

开发植物源杀菌剂是当前新农药研究开发的一条重要途径，是发展有机农业、 促进农业

可持续发展的理想农药。 有效植物源杀菌剂的筛选及其生物活性测定将是植物源杀菌剂应用

于植病生防工作的基础。

二、实验目的

通过实验了解植物源杀菌剂的常规筛选技术，学习生物活性测定的主要方法。

三、实验材料及准备

1. 实验材料

（1）供试药剂 苦参、五倍子、连翘、黄芩、白头翁、蛇床子、板蓝根等的乙醇提取

物。提取制备过程为 95%乙醇冷浸提、抽滤，滤液减压浓缩至膏状物，4℃冰箱保存。测定

时分别以乙醇溶解至10%、5%、1%的溶液。

（2）供试病菌 黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）

（3）培养基 PDA培养基

（4）供试植物 黄瓜幼苗

2. 实验器具 打孔器、培养皿、培养箱、玻片、显微镜、喷雾器、接种针、塑料薄膜

等。

四、实验方法及步骤

1. 抑制菌丝生长效果测定

采用菌丝生长速率法。

①吸取一定量植物提取物混入 PDA 培养基（培养基温度 50℃左右），混合均匀后倒入

培养皿中制成含药培养基平板。

②用打孔器从黄瓜灰霉病菌培养平板上截取菌碟，放到不同药液处理后的培养基中，

25℃条件下恒温培养，设不加药液的处理为对照。

③5 d后用直尺采用十字交叉法测量供试病原菌在不同含药培养基上的菌落直径，计算

各药液处理对菌丝生长的抑制作用。

2. 抑制孢子萌发效果测定

采用孢子萌发法测定。

①取经 70%酒精消毒过的玻璃环，在其上下两端涂凡士林，粘在玻片上，并在环内加

入几滴无菌水。

②取一洁净的盖玻片， 在其上滴加植物提取物和黄瓜灰霉病菌的孢子悬浮液， 迅速翻转，

放于玻片上，使其形成悬滴置于该玻片上。

100% - %   对照菌落生长直径 处理菌落生长直径） （对照菌落生长直径 ） 菌丝生长抑制率（

③将玻片放入培养皿中，25℃条件下恒温培养。

④24 h后在显微镜下观察，统计萌发率，并计算出各处理的孢子萌发抑制率。

3. 抑制发病效果测定

采用子叶法测定。将各浓度药液 3 mL用喷雾器喷至子叶完全展开的幼苗上，待药液晾

干后，每片子叶上菌面朝下接种直径 0.5 cm 的黄瓜灰霉病菌菌饼一个，塑料薄膜密封，25

℃条件保湿培养，3 d后调查发病情况，计算病情指数及相对防效。

五、实验报告

1. 菌丝生长法和孢子萌发抑制法的实验结果是否一致？

2. 根据实验结果，初步筛选可用于黄瓜灰霉病防治的植物源杀菌剂。