林木病害研究法

实验指导

甄志先 主编

2012.2

2 目 录

实验：12学时

1. 标本的采集和制作 2

2. 培养基的制备和灭菌 4

3. 病原菌的分离培养和保存 4

4. 柯赫氏法则（二）接种诱发和病原物致病性的证实 2

5. 病原菌大小的显微测量 2

6. 病原细菌的拮抗菌的筛选 2

3 实验一 标本的采集和制作

一份好的病害标本本身就是最完整的症状描述和性状特征的记载。因此标本的采集和制作，无

论在教学还是科研上都是很重要的。

1．目的要求 通过采集和制作标本，了解植物病害标本采集要求，记录，掌握植物病害标本的制作

方法。每人鉴定 10 份病害标本。

2．材料和用具 标本夹、吸水纸、塑料袋、纸袋、标签、铅笔、记号笔、小刀、手锯、标本缸、醋

酸铜、硫酸铜、95％乙醇、甲醛溶液、亚硫酸、甘油、蒸馏水。

3．内容与方法

3．1 病害标本的采集

（1）采集标本应准备的工具和材料有：标本央、标本箱、标签、记录本、铅笔、记号笔、小土

铲、刀、、锯、剪、锄头

（2）采集地的地理生态条件要紧密联系病害的发生条件、病原物的生物特性等考免

如采集鞭毛茵亚门真菌，应在潮湿低洼的地方或易积水结露的部位寻找；寄生性种子植物应与寄主

相联系，列当在高纬度地区的双子叶草本植物上寄生，独脚金在低纬度地区的单子叶植物上寄生，

拇寄生类则在木本桓物的茎秆上寄生，表现蔫萎的桓株要连根挖出，有时还要连同根际的土壤等一

同采集。对于粗人的树枝和植概则宜削取一片或割取一截。有些野生植物上的病害症状很特殊，采

集时一定要连同植株的枝叶或花一起来集，以便鉴定其寄主名称。

（3）取样部位：标本上有子实体的应尽量在老叶上采集，因为它比较成熟，许多真菌有性阶段

的子实体都在枯死的枝叶上出现，而无性阶段子实体大多在话体上可以找到。柔软多汁的子实体或

果实材料，则应采集新发病的幼果。病毒病应尽量采集顶相与新叶。线虫病害标本应采病变组织，

为害根部的线虫病官标本除采集病根外还应采集根围土墩。

（4）完整的记录与标签同样十分重色要有寄主名称、采集日期与地点、采集者姓名、生态条

件和土壤条件等。

3．2 病害标本的制作 从田间采回的标本，除一部分用作分离鉴定外，对于典型的病害症状最好

是先摄影然后再压制或浸泡保存。

压制或浸渍的标本尽可能保持其原有性状，微小的标本可以制成玻片，如双层玻片、凹穴破片

或用其它小玻管小袋收藏。

3．2．1 标本的摄影 通过摄影将病害症状的自然状况记录下形使用彩色胶卷还能表现标本的真

实色歉效果更好。

3．2.2 标本的干燥保存 干燥法最简单、最经济、应用最广，适用于一般含水较少的茎、叶等病

害标本的制作。将采集的标本夹在吸水纸中，同时放入写有采集地点、日期和寄主名称的标纸再用

标本夹压像后日晒或加温烘烤．使其干燥，干燥愈快愈能保持原有的色绎，标本质量亦愈高。夏季

4 采的标本在温湿度高的情况下，容易发窃变色，换纸宜勤，通常在压制的最初三、四天每天换纸 I

一 2 次（视标本含水多少，及温湿度情况而定） ，以后每二、三天换一次，至完全干燥为止。在第一

次换纸的同时，应将标本加以整理，因经初步干燥，标本变软易于铺展。烟草、蚕豆、梨、马铃薯

的茎叶等很易发黑变色，都是很难保存颜色的标本在制作过程中特别要注意快速干燥，用电熨斗烫

压或热砂重压是值得采用的方法。需要保持绿色的干制标本，可先将标本在 2—4％硫酸铜溶液中浸

24 小阶或经过醋酸铜溶液（配方及方法见浸渍法中醋酸铜的捏渍法）处理后再压制。也可以在叶面

抹一层液体石蜡后再压，可以保持鲜绿色 2—3天。

3．2．3 浸渍法 多汁的病害标本，如果实、块根或担子菌的子实体等，必须用浸渍法保存。浸

渍液体种类很多，有纯属防腐性淑亦兼有保持标本原色抵现介绍数种常用及效果较好的方法。

（1）防腐浸渍法：此类浸渍法仅能防腐而没有保色作用，保色的标本，洗净后直接浸于以下溶

液中。

①5％福尔马林浸渍法。

②亚硫酸浸渍液：1000ml 水中加 5—6％亚硫酸15m1（一般市售的亚硫酸含量为5—6％）或用

亚硫酸钠 10．5g，浓硫酸 8m1，水 500m1 配成混合液。

（2）保持绿色标本的浸渍液及浸泡法：

①醋酸铜保（绿）色浸渍法：往 50％的醋酸中逐渐加入醋酸铜结晶溶解至饱和作为母浓（大约

1000ml 50％的醋酸中加入 15g醋酸铜即可达饱和） ，使用时兑水稀释 3—4倍（稀释倍数视标本颜色

而异，色深者稀释倍数可小些） 。

将此液加热煮沸，投入标本，开始时标本的绿色被漂去，再经数分钟后标本又恢复绿色，此时

立即将标本取出，用清水洗净，保存于5％的福尔马林溶液中，此法称为热处理。

冷处理的办法是将标本置于上述稀释液中浸 3 小时后标本褪色，再经 72 小时后标本恢复绿色，

此时将标本取出，取水冲净，保存于 5％的福尔马林溶液中。

此法保持色泽时间校长，其保色原理大致是铜离子与叶绿素中的镁离子发生置换作用。

所以，溶液经多次处理标本后，铜离于会逐渐减少。如要继续使用，应补入适量的醋酸铜，此

法保存标本往往略带蓝色，与植物标本原色稍有出入。

②硫酸铜保（绿）色浸渍法 用清水冲洗标本，直接浸泡在 5％的硫酸铜溶液中 1—7 天，待标

本略带褐色时取出，用清水漂洗去标本表面多余的硫酸铜溶液，然后保存在亚硫酸浸渍液中。

③保存黄色和桔红色标本的浸渍液：保存杏、梨、柿、红辣椒等果实标本用亚硫酸浸渍液，亚

硫酸浸渍液有漂白作用，因此使用时安注意浓度，一般用 1％即可（浸杏时浓度可再稀些） ，因浓度

太小，防腐力不够，可加入适量酒精。为了防止果实崩裂，可加入少许甘油。

④保存红色标本的浸渍液：保存标本红色较难，因为红色是水溶性的花青素，很难保存。常用

Hesler 浸渍液保存，成分有氯化锌 50g，福尔马林 25mI，甘油 25m1，水 1000m1．将氯化锌溶于热

5 水中，加入福尔马林，如有沉淀，用其澄清液。此溶液适用于由于花青素而显红色的标本，如苹果、

番茄等。

3．3 标本的保存 制成的标本，经过整理和登记，然后依一定的系统排列和保藏。

菌类标本一殷按分类系统排列，要有两套索引卡片，一套是寄主索引，一套是茵类索引，

以便于寻找和整理。

标本室（柜）应保持干燥、清洁，并要定期施药以防虫蛀与霉变。

3．3．1 标本盒保藏 教学和其他用的干制病害标本，采用玻面纸盒比较方便．玻面纸盒的适宜大

小为 20 x 28x 2cm。纸盒中先铺一层棉花，并在棉花上加少许樟脑粉以驱虫。最后在棉花上放上标

本和标签。

3．3．2 标本瓶保藏 浸渍的标本放在标本瓶内保藏，为了防止标本下沉和上浮，可绑在玻璃条上

然后再放入标本瓶。标本瓶的口盖好后施加石蜡封口，然后贴上标签。

3．3．3 纸套内保藏 用牛皮纸叠成 15x 32cm的纸套，纸套的叠法见下图。

大量保存的干制标本，大多采用纸套保藏，将标本装入纸套内，并在纸套上贴好标签，放

于标本柜中即可。

几种纸套的叠法

3．4 病害标本的鉴定 每人对自己所采集的标本及时进行鉴定，参考有关图谱和资料，鉴定出属

名和种名。

6 4. 作业与思考题

（1） 病害标本是否一定要压制或浸泡保存 2

（2） 仁果浆果病害如何保存?

（3） 每人上文 10 份已鉴定好的标本。

7 实验二 常用培养基的消毒与灭菌

基本原理：在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁

殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以

及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适 pH 范围内才能生长得更好，因此，对不同种

类的微生物应将培养基调节到一定的 pH 范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。

培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和

半固体的三种。 固体培养基是在液体培养基中加入 1.5 %～2 %的琼脂， 半固体培养基是加入 0.2 %～

0.5 %的琼脂。琼脂（agar） 起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自

然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培

养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养

基（PDA） 、肉汁胨培养基（NA）等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何

成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏（Czapek）培养基等。

根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴

别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原

真菌。

在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。

一、实验目的

1．学会制作普通的培养基。

2．掌握常用的消毒灭菌的方法、原理

真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。不同类群的微生物

对营养条件的要求不同。因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。培养基就是按

照微生物生长，繁殖所需的各种营养物质，用人工的方法配制的基质。

二、实验内容

1．常用培养基的配制

植物病理实验室所用的培养基与一般微生物培养基大致相同，只是植物质培养基用得多些。

（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基

这是使用最频繁的培养基，简称 PDA，主要用于真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细

菌的培养。配方为：

马铃薯 200g 葡萄糖（蔗糖） 10～20g

琼脂 17～20g 水 1000mL

8 配制方法：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。）切成薄片或蚕豆大

小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水 1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，

用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒

不断搅拌， 以免烧焦锅底。 再加入事先用温水溶化的糖溶液， 用二层纱布过滤。 测定 pH 值， 用 1mol/L

的 NaOH或 HCl 调至 pH 为 5.5～6.5 之间，最后加水补足至 1000mL。

实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，

硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。

（2）肉汁胨培养基

肉汁胨培养基主要用于细菌的分离和培养。可以配成培养液体或琼脂培养基使用，配方为：

牛肉浸膏 3g 蛋白胨 5～10g 水 1000mL

将称好的牛肉浸膏和蛋白胨溶于水中，酸度调至 pH 7，分装灭菌。

每 1000mL肉汁胨培养液中加琼脂 17～20g，加热，充分搅匀，冷却即配成固体培养

基。

（3）植物组织和煎汁

许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能

做培养基使用。植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可

用作培养液，如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须灭菌后才能使用。

马铃薯斜面的制作：用木塞穿孔器切取直径比试管直径略小的柱状薯块，将马铃薯块切成

斜面。试管底加小块脱脂棉和水 1mL，然后放入马铃薯斜面，加上棉塞后灭菌。有些真菌（如

镰刀霉属）能在上面产生孢子，有些不容易在琼脂培养基上生长的植物病原细菌，在马铃薯斜

面上生长良好。

（4）玉米粉琼脂培养基

这种培养基的养分较少，一般真菌在这种培养基上生长较差，但适用于菌种保存，有些真菌

能在这种培养基上产生孢子和子实体。配方如下：

玉米粉 200g， 琼脂 17g， 水 1000mL

量取 500mL水，加热至 70℃， 加入玉米粉， 保持温度在 60℃左右约 1 小时，用纱布过滤后，

加入适量的水补足 500mL。另取 500mL水，加入琼脂，加热使之慢慢融化，过滤后补足水至

500mL。两液混合后分装，灭菌备用。

2．培养基的分装

根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或锥形瓶中。

试官分装时，取玻璃漏斗一个，装在铁架上，玻璃漏斗下连接一根乳胶管，乳胶管的另一端连

接一细玻璃管，乳胶管上加一止水夹，操作时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管插入

试管内，以右手拇指与食指开放止水夹，中指和无名指夹住玻璃管，使培养液直接流入试管内。

9 装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的 1/5左右，用锥形瓶分装培养基

时，容量不宜超过容积的一半。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。

3．灭菌及斜面、平板培养基的制作

将加好棉塞的试管 4～5 支捆扎好，用牛皮纸（或两层报纸）包住管（瓶）口，然后灭菌，做

平板培养基要用的培养皿等，要事先洗净、烘干、包装好，进行干热灭菌。

试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度

为试管长度的 2/5 至 3/5， 冷凝后即成斜面培养基。 三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，

制作平板培养基。方法是：将培养基冷却至 45～50℃（低于 45℃易凝固，应在水浴锅中加热融化），

左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧

瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约 15mL，平置、凝固

即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用 70%酒精消毒。

4、灭菌与消毒

灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消

灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，

因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可

分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

（1）热力灭菌

热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1）干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内

的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝

固就越快， 反之含水量越小， 凝固越慢。 因此， 与湿热灭菌相比， 干热灭菌所需温度高 （160～170℃） ，

时间长 1～2 h。 但干热灭菌温度不能超过180 ℃， 否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦， 甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具

如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在

蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气（160～170℃）进行

灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘

箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；

电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

2） 湿热灭菌

〈1〉 高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min

进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌

适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。

〈2〉 常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于

不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这

10 种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过

100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以

杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。

常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热 100℃，30 min，连续 3 d，第一天加热后，

其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下 18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加

热 100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。

（二） 过滤除菌

许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，-均会被热破坏，因此采用过滤除

菌的方法。应用最广泛的过滤器有：

（1） 蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分

上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。

每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为 3 种型号：K 型最大，作一般澄清用；EK

滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S 滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。

（2） 微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的

薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和人口连接装置的塑料盖盒组成。出口处可连接

针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装人两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器

时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，

可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤

量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般

为 0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：

① 组装、灭菌 将 0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用

（0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min）。连接。

③ 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用

力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。

（三）辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。 波长为 200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，

其中以 260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正

比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和 DNA的交联，从而抑制了 DNA

的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使 O2氧化生成臭氧（O3），或使水

氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3 和H2O2 有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、

接种箱的空气及物体表面的灭菌。

注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，

更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过 1.2 m为宜。

此外，采用60Co-γ 射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料

制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ 射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条

件下灭菌。

（四） 化学药品灭菌

11 化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌

代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不

能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀

菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处

的环境等有关。

植物病理学实验室中常用的化学药品有 2％甲酚皂溶液（来苏尔）、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、

3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术， 而且在

医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条

件选用合适的消毒灭菌的方法。

三、作业：每组交配制好且消毒灭菌的培养基一份。

附: 高压灭菌

1、目的要求

学习灭菌与消毒的基本原理及应用范围，学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

2、基本原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的

水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽后关闭排气阀，继续加热，此

时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100℃的温度，导致

菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，锅内冷空气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于

水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽

的温度。

灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用

0.06 MPa、112℃灭菌 15 min，但为了保证效果，可将其他成分先行 121℃灭菌 20 min，然后以无菌

操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 0.1MPa，121℃灭菌 20 min；即可，而盛

于大瓶内的培养基最好以 0.1MPa、122℃灭菌 30 min。

实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式两种。其结构和工作原理相同，本实验以

手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法。全自动高压蒸汽灭菌锅在设定好有关的参数后，加

温、放气、灭菌、干燥可一次完成，使用方法可参照厂家说明书。

3、材料、试剂与仪器

材料 马铃薯葡萄糖培养基 （PDA）。

仪器与用具 培养皿、手提式高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉等。

4、操作步骤

（1） 首先将内层锅取出，向外层锅内加人适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

提示：切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

（2） 放回内层锅，并装入待灭菌物品。

提示：注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁

接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

（3） 加盖 并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个

12 螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

（4） 用电炉加热 并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上

排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，调节电炉控温旋

钮，维持压力至所需时间。本实验用 0.1Mpa l21.5℃，20 min灭菌。

提示：灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此，锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，

维持所需压力。

（5） 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，打开

排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

提示: 压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀开盖取物。否则会因锅内压力突然卞降，使容器内的

培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

（6） 将取出的灭菌培养基放入 25℃温箱培养 48 h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

13 实验三、病原物的分离与培养

基本原理：柯赫氏法则（Koch’s Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，

是诊断病害中的证病律。其基本步骤如下：

1．在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物；

2．从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养；

3．将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状；

4．从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。

全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。包括实验十三培养基的制作和本次实验病原物

的分离、培养及纯化。

一、实验目的

掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。

二、实验材料与用具

1. 分离材料

杨树腐烂病 （Valsa sordida）、 杨树溃疡病 （Botryosphere ribis） 和杨树黑斑病 （Marssoniabrunnea）

病材料。

2. 仪器和用具

超净工作台、微波炉、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、吸管、吸水纸、酒精灯，解剖刀、医用剪刀、

医用镊子、PDA培养基、培养皿（Φ9cm） 、灭菌水、70%酒精（内放脱脂棉球） 、0.1%升汞瓶 1个，

5%乳酸瓶、火柴、记号笔、废液缸、250mL锥形瓶、漏斗、试管、2000mL烧杯、小烧杯、移液管、

止水夹、石蕊试纸、乳胶管、报纸、棉花、医用纱布、解剖剪、接种环、酒精灯、医用青霉素和链

霉素。

0.1%升汞溶液配制： 升汞 1g 浓盐酸 2.5 mL 蒸馏水 1000 mL

先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。

三、实验内容

（一）真菌的分离

1．分离前的准备工作

分离和培养应在很清洁，甚至无菌的条件下进行。如在无菌室、无菌操作箱、超净工作台和清

洁的室内。无菌操作箱的内壁可以用升汞液（1：1000）擦洗，使用超净工作台应事先开动运行 15

分钟左右。在屋顶四壁清洁而空气较静止的房间进行时，要将地面扫净擦湿，用 1：1000 的升汞液

14 或清水擦净工作台，并在台上铺一块干净湿白布，将所需物品都放在台布上，工作时避免走动，以

减少污染。

2．分离材料的选择

选择新近发病的植株、器官或组织作为分离材料，可以减少腐生菌的污染。从病健交界处分离这一

原则对于大部分病害的分离都是适用的。而有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中

央的坏死组织中，从斑点边缘是分离不到病菌的。

3．组织表面消毒

从植株或组织上取下的分离材料，必须进行表面消毒，以杀死或减少病组织表面的腐生菌，保留组

织内部的病原菌。常用的表面消毒液有：

（1）升汞消毒液

配方为：升汞 1g， 浓盐酸 2.5mL， 水 1000mL。

将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。升汞剧毒、无色，为便于认识，可在

溶液中加几滴红染料。消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般3～5 分

钟。消毒后用无菌水冲洗 3～4次。

（2）漂白粉消毒液

有些真菌对汞、铜等金属离子敏感，可用漂白粉消毒液。其配方为：

漂白粉 10g， 水 140mL。

选用新鲜漂白粉，将漂白粉溶于水中，过滤后使用，随用随配，不能久留，否则因挥发而

失去杀菌能力。一般处理 3～5分钟，消毒时间亦因材料而异，处理种子用5～10 分钟。消

毒后用无菌水冲洗，有时也可不必冲洗。

（3）酒精和其它消毒剂

70%酒精也是常用的表面消毒液。将材料在酒精溶液中浸数秒钟到一分钟，然后水洗。有些

幼嫩组织只需用脱脂棉蘸酒精溶液少许，擦涂表面，待酒精挥发后，即可放在培养基上培

养。

对于特别幼嫩的病组织，因对药物敏感，可以用灭菌水洗 8～9 次。

4．分离方法

常用的分离方法分为两大类：

（1）组织分离法

15 分离一小块染病组织，经表面消毒后，移植于平板培养基上培养。很多材料适用此法，下

面介绍几种：

斑点病病原菌的分离：挑取新鲜典型的病斑，在病健交界处，剪取 5mm 2 的染病组织，在

70%酒精中浸数秒钟，然后移入 0.1%的升汞溶液中处理 3～5 分钟，用无菌水冲洗 3次，移入

平板培养基上培养。

维管束病菌的分离：先用 70%的酒精将根茎表面擦拭消毒，然后用灭过菌的解剖刀剥去表

皮，再切取其中一小块变色的部分，用升汞液或漂白粉液消毒，用无菌水冲洗几次后，移到培

养基上培养。

种子内病原菌的分离：用升汞溶液或漂白粉溶液进行种子表面消毒，然后用无菌水冲洗，

再移于平板培养基上。

（2）稀释分离法

用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积

的菌液至平板培养基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移

至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至 45℃的培养基，轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。

并在皿盖上写上日期、分离物名称、分离者姓名。

分离工作有时并不顺利，要从分离材料、培养基、培养条件及操作处理方法等方面找原因，

改变工作方法，不断进行试验

（二）菌种的纯化

按照上述步骤分离病原物，如果材料很新鲜，本身很少污染，有可能一次分离出纯培养菌。然

而多数情况下会发现同一培养皿中有不同的菌落，要做菌种的纯化。纯化的方法很多，下面介绍三

种方法。

1．琼脂平板稀释纯化法

将菌种上产生的孢子用无菌水冲洗下，在无菌培养皿中适当稀释后（大致每个培养皿中只有 30 个左

右的孢子），取一定量的孢子悬浮液与融化后冷却至 45℃左右的琼脂培养基混合，制成平板培养基，

在适宜温度下培养。然后，从形成的单个菌落边缘上分离菌丝到斜面培养基上培养。

这种方法实质上是分离菌落，主要用于酵母菌和细菌等的纯化，也适用于其它产生孢子较多的真菌

的纯化。操作简便，但不能确定一个菌落是否从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。

2．干孢子分离法

干的孢子，如黑粉菌的厚垣孢子和有些担子菌的担孢子等，可用细的缝衣针或解剖针挑取。先将干

孢子放在灭菌的玻片上，用食指和大拇指握住缝衣针，在低倍镜下检查，当针尖接触孢子时，孢子

即离开玻片附在针尖上，然后移到适宜的培养基上培养。不过，初学者较难成功地利用此法。

16 3．菌丝尖端分离法

此法适用于不产生孢子或产生孢子而孢子不容易分离的真菌。将真菌培养在培养基表面，用低

倍镜找到单独的菌丝尖端后，用内径 0.5mm左右的毛细管从菌丝尖端徐徐插入，连同培养基将菌丝

尖端切下，然后将这一带有培养基的菌丝移到新的培养基上培养。

（三）真菌的培养

无论是从病部移到培养基上的病原菌，还是准备用于回接到寄主上的病原菌，都要在一定条件

下培养。根据试验的要求，可将纯化的菌种，移植到适当的固体或液体培养基上培养，也可以用锥

形瓶盛麦粒、玉米粉、麦秆、锯末、麸皮等培养基质，进行大量繁殖。

一般真菌只要满足 20～30℃的温度即可生长，少数真菌由于研究其生理的特殊需要，应在一定

的恒温条件下培养。

培养过程中要注意检查和记载，一般真菌经 24小时培养后即可检查其生长情况，如：有无污

染、温度是否合适等。真菌的培养性状最好是培养在琼脂平板培养基上观察和描述，观察和记载的

项目主要有：

1．菌落的质地；

2．菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；

3．形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；

4．各种子实体和休眠结构（厚垣孢子、菌核等）的形成及所需的时间；

5．菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培养基中；

6．有无特殊气味；

7．菌落中有无部分呈扇形；

8．生长率的快慢，如菌落长到一定直径所需的时间。

菌落的颜色也要仔细地不断地观察，它的颜色往往随着培养时间而改变。此外，培养性状的描

述，要注明培养基的种类、培养温度和有无光照等。

五、作业

1．每人交纯菌种试管一支。

2．书面报告分离结果，有无污染发生，分析原因。

17 实验四 柯赫氏法则（二）接种诱发和病原物致病性的证实

一、实验目的

1．深对病原物传染、侵染等概念的理解；

2．掌握几种常用的接种方法；

3．在上一次试验的基础上，了解柯赫氏法则的全过程。

二、实验材料与用具

1.材料

杨树腐烂病（Valsasordida）、杨树溃疡病（Botryosphere ribis）和杨树黑斑病（Marssonia

brunnea）病菌。

2. 仪器和用具

恒温恒湿箱、小喷雾器、显微镜、接种针、接种环、酒精灯、70%酒精等。

三、实验内容

（一）种子传染病害的接种

1．拌种法 用病菌的孢子拌种是黑粉菌常用的接种方法。

2．浸种法 孢子悬浮液浸种也是常用的方法。浸种时抽气减压，可以使孢子渗入种子内部，从而提

高接种效率。在人工培养基上不易产生孢子的病原菌，可以用搅碎的菌丝悬浮液浸种。

（二）土壤传染病害的接种

1．土壤接种法 是将病菌在播种前或播种时半在土壤中的接种办法。如立枯病即可将人工培养的菌

丝拌入灭菌的土中，然后播种。在所有病害的接种实验中，以土壤接种最为复杂。主要原因是病菌

易受土壤物理、化学及生物学性质的影响。

2．蘸根接种法 是将幼苗的根部稍加损伤，然后将受伤的根部蘸上孢子或菌丝悬浮液的接种方法。

这种方法使病菌能与根部直接接触，受土壤微生物的影响较小。同时，根部有损伤，病菌也易侵入，

效果比土壤接种法好，常用于枯萎病等的接种。

（三）气流和雨水传播病害的接种

1．喷雾法 将孢子（或菌丝）悬浮液喷洒在寄主表面，病菌可以从气孔、伤口和表皮直接侵入。叶

背气孔数目一般比叶正面的多，对于从气孔侵入的病菌，则应注意喷洒叶背；对于从伤口侵入的病

18 菌，喷洒前应用细砂土或金刚砂摩擦叶面，使叶表稍损伤；叶面有蜡质的，接种时可用湿布将蜡质

层擦去。

如苹果早期落叶病的接种——喷雾法

1）．取苹果早期落叶病病菌的纯培养，用无菌水配成孢子悬浮液，使悬浮液中的孢子在显微镜

的低倍视野中有 10 个左右。然后，将此悬浮液装入小喷雾器中。

2）．取培育的苹果苗两株（无病），一株喷孢子悬浮液，注意叶片两面都要喷湿，另一株喷洒

请水，作为对照。

3）．将上述苹果苗放在同样的恒温恒湿箱中培养，24 小时后取出，置于温室内，进行正常管

理。逐日观察症状，记载发病情况。

2．喷粉法 是将一定量的干孢子与滑石粉混匀后，放在小喷粉器中喷洒在潮湿的植物表面的接种法。

滑石粉的量一般是孢子量的 10倍左右。如白粉菌和锈菌等的接种。

3．涂抹法 涂抹法是先用手指蘸水摩擦叶片，去掉蜡质层，使表面有一薄层水膜，然后将孢子涂抹

在上面的接种法。

喷雾、喷粉和涂抹接种后的植物，必须保湿约 24 小时左右，使病菌孢子能萌发侵入。

4．注射法 是将病菌孢子悬浮液用注射器注入寄主生长点或幼嫩部分的接种法。

5．针刺法 是指用灭菌的针刺伤寄主植物组织，然后将病菌接种在伤口内或用灭菌的针蘸菌脓刺伤

寄主组织的接种法。此法用于伤口侵入的病菌。如块茎、果实、块根等的腐烂病菌。

如杨树溃疡病的接种——针刺法

取杨树枝条一个，洗净，用脱脂棉蘸 70%的酒精少许，在接种部位涂拭消毒，晾干后，用灭菌

的解剖针刺伤，用灭菌的接种环挑取少许溃疡病菌的纯培养，接种在刺伤的部位。另选一处刺伤后

不接种病菌，作为对照。每个枝条可做3～5 个重复。然后，将枝条放在玻璃瓶中离体培养，放入

25℃的恒温箱中。逐日观察症状，记载发病情况。

（四）昆虫传播病害的接种

昆虫主要作为病毒病的传播媒介，接种方法详见实验七。

五、作业

1．将接种过程及结果写成书面报告。

2．接种试验为什么要设对照，保湿的意义何在？

19 实验五 显微描绘与显微计测

微生物的个体很微小，大小又有很大差异，在日常调查研究中经常要测量孢子、菌丝体、于实体

以及其他观察到的物体的大小，有的还要在显微镜下描绘所观察的对象，如微生物的形态和寄主的

改变等，通过计测和描绘，特观察的结果用数字或图来表示，才能把自己工作中见到的相似、相近

的病原曲加以区别，也有利于与前人以及国内外同行工作者助工作进行比较。

一、目的要求

学习显徽镜计测和显微描绘的一般方法。要求掌握目镜测微尺的标定方法，测量加一 2 种病菌

孢子大小，学会在显微镜上安装和使用显微描绘仪并描绘出 l 一 2个病菌孢子。

二、材料和用具

目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、显微措绘仪、培养皿、玉米小斑病菌或苹果炭疽病病

菌抱子悬浮液或棍花炭疽病菌、白粉病菌树料、蒸馏水、吸管。

三、内容与方法

（一）显微计测

1 孢子大小的测量

显微测量是在显微镜下测量现察物体的长度、面积和位置。所用工具主要是镜台测微尺和目镜

测微尺。

（1） 目镜测微尺是放在目镜内的一种标尺，有两种类型，即固定式与移动式。固定式目镜

检测尺为一块圆形玻璃片，直径为 20 一 21 毫米，在它的上面刻有两种形式的标尺，即直线式和网

式，前者适宜测量标本长度，后者用来记数目和测量物体的面积，也可测量长度。使用目镜测微尺

时，先将目镜白镜筒中抽出，旋去接目透镜，然后将目镜测微尺放在镜镜的光阑处，注意有刻度的

一面朝下，再相接目镜旋上，插入镜筒。

在显摄镜下，测微尺的每一刻度代表的大小（长度或面积，，因显微镜放大倍数及镜简长度而

不同，因此在使用接目测辙尺测量抱子之前，必须用一个标准的长度来进行标定，这就是镜台测微

尺。

（2） 镜台测微尺是一种特制的玻片，在它的中央有极细的刻度标尺，全长为 1mm，共划分

为 10 大格、100 小格，每小格为 0.01mm，即 l0um。标尺的外围有一黑色的粗线环，便于寻找，标

尺用圆形盖玻片封牢。

（3） 标定接目测微尺的方法和步骤：测量时，目镜测微计与镜台测微计配合使用。首先将

镜台测微计放在载物台上，如前述的操作过程对准焦距，移动破片使刻度标尺的一端重合，再寻找

两个标尺的另一重合刻度，使镜台测微尺有任何两条线与接目测微尺的两条线重合时，分别记下接

目测微尺和镜台测微尺的格数，如此观察三次，计算接目测微尺每格的平均长度。

20

每个同学按上述方法标定目镜测微尺，重复三次，并算出接目测微尺在低倍镜和高倍镜下

每格的长度分别是多少?

（4） 孢子大小的测量：目镜测微尺标定结束，移去镜台测微汁，换用待测标本的玻片，

对准焦距，就可以用目镜侧微计的标尺测算标本的长度。通常在病原物生物图上要标有相应的

比例尺。

取培养的玉米小斑病菌配成孢子悬浮液，滴于载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下或高倍

镜下测量分生孢子的长和宽，选其大小不同的孢子各30 个。

（5） 孢子计测应汁意的问题

a．材料要新鲜。

b．一种真菌在不同的寄主上孢子的大小可以不同，即使在同一寄主上，野兽气候和其

他环境的影响而有变化。

c．计测的袍子应该是成熟的孢子。

21 d．计测时所用的浮载剂可能影响计测的结果。

e．孢子计测的数目常影响所计测病原体的准确性、一般来说，量菌丝体的宽度，分生孢子梗

的长和宽，子囊、子囊壳和分生孢子器的大小，各量5—6 个即可，分生孢子要量 20—30 个。

f．孢子的大小记载及表示方法不一，有的仅计平均值，有的记载其大小的幅度。例如，幅度

是 8—12pm，即可知平均值约为 l0 um，或幅度为 3—6x 20—40Km等，这就指出了最普遍的大小及

其变异范围。

2 真菌孢子或细菌数量的计测

测定液体中孢子浓度的方法很多．除了菌落计数和比浊法外，常用的是用血球计数板来测量孢

子的数量。

（1） 血球计数数板是一块特制的加厚的载玻片，在中部有 4 条纵槽，1 条横幅组成H 形，在

上下两个大框中刻有高度精确而纤细的刻线，加放盖玻片后，上下两方框离盖玻片的距离为0.1mm，

在每个方框中有 9 个边长各为 lmm的大格中间一个大格的部位（血球计数室）适合测孢子的数量，

这个大格的边长 1mm，面积为 lmm 2 。这个大格又分成 25 个中格，每个中格都用双线分开，中格边

长 0.2mm， 面积为 0.04mm 2 。 每个中格又分为 16 个小格， 每个小格边长为 0.05mm， 面积为 0.0025mm 2

＝l／400mm 2 ，所以每个大格的体积 lmm 2 ×0.1mm＝0.1mm 3 。

每个中格的体积 0.0 4mm 2 ×0.1mm=0．004mm 3

每个小格的体积＝1／400mm 2 ×0.1mm＝1／4000mm 3 。

每毫升孢子数量=每小格平均孢子数× 4000 ×1000=每个小格有菌数×40 000 000

（2）菌液孢子浓度的测定：首先格培养的茵液摇动均匀启用滴管滴在中央平台上，盖上盖玻片，

如果菌液浓度过大，则要先稀释再将稀释的菌液用来镜检、计数。通常检查

5 个中格内的抱子数，5 个中格分别在四个角上和中央，共计 80个小方格内的袍子总数。

计

数的方格多且分布在不同方位上，可以避免抱子在各方位上分布不均所造成的误差。

每毫升测量的菌液中抱子浓度＝80个小格个抱于总数 x 义四黑 LJLL

＝80 个小格中袍子总数 x 500000

（二） 显微测绘

在显微菌检时，可以徒手描绘，但是技准确的是用显微描绘仪。显微描绘仪的种类很多，它们

都是利用棱镜折光的原理，操作关键是要调节光线，当显微镜中病茵上的光亮度与绘图纸上的笔尖

上的光亮度相接近时，就能按实物的形状描绘。在使用时应注意的事项如下，

（1）反光镜位置的角度应该是 45。。

〔2）在末画完之前切勿移动描绘仪和绘图纸。

（3）描绘用的铅笔笔头要削尖。

22 （4）调节显微镜光的强度，使所描绘的物体与笔尖都能同时看得招清楚。

（5）先用描绘仪绘出草图，然后再作精细的修整。

每个同学在显微镜描绘仪下描绘玉米小斑病菌分生把子，先作草图，然后整理。

四、实验时间 3学时。

五、作业与思考题

（1）测量病菌的分生袍子大小并写出报告，并用显微描绘仪绘图。

（2）进行显微描绘时，时常发生看不清病菌或看不清铅笔久应该怎么办才能使病

纸和笔尖都清楚?

（3）为什么要用显微描绘来绘图。

23 实验六 拮抗细菌的筛选

一、目的要求

学习显徽镜计测和显微描绘的一般方法。要求掌握目镜测微尺的标定方法，测量加一 2 种病菌

孢子大小，学会在显微镜上安装和使用显微描绘仪并描绘出 l 一 2个病菌孢子。

二、材料和用具

玉米小斑病菌或苹果炭疽病病菌抱子悬浮液或棍花炭疽病菌、白粉病菌树料、蒸馏水、吸

管。植物病原真菌供试芒果炭疽病菌为本研究室保存菌种。 培养基采用的培养基为 PDA、肉

汁胨培养基和加牛肉浸膏的 PDA。PDA 用于拮抗作用的测定，肉汁胨培养基用于拮抗细菌的

保存和培养。

三、内容与方法

1 芒果炭疽病菌的培养和分生孢子悬浮液的制备从斜面中取一小菌块，移接于 PDA 平板上活

化、培养，当菌落上出现粉红色的分生孢子堆时，用灭菌接种针从孢子堆上挑取少量孢子，用

灭菌水稀释成一定浓度的分生孢子悬浮液，备用［9］。

2．土样的采集从含有机质丰富的地表采集土壤样品，详细记录采集地点及邻近作物（芒

果、蔬菜等）的种类，并做好标记，置于 4℃冰箱保存，备用。

3 滤膜空斑法分离拮抗细菌的步骤每一土壤样品称取5g， 加灭菌水50mL， 剧烈振荡5min，

将其稀释成 10－2～10－5 不同浓度梯度的土壤悬浮液，于每个 PDA平板中加入 200μl 涂布；

5～7h后， 在该 PDA表面铺上灭菌的微孔滤膜， 在滤膜上加入 200μl 孢子浓度为 1×107 个/mL

的芒果炭疽病菌孢子悬浮液，小心涂匀后倒入 5mL冷却至 45℃左右的 PDA，于室温下培养；

第 10h开始，每隔 6h观察 1 次，直到微孔滤膜表面的 PDA出现菌丝层时，仔细检查菌丝层上

是否出现空斑（透明的斑点），如有，则标记空斑的位置，并将微孔滤膜连同上面的 PDA取出，

根据记录的空斑位置，用接种针在留于皿中的 PDA 平板表面的相应位置蘸取少量细菌，用肉

汁胨平板划线纯化 2～3 次后保存在肉汁胨斜面中供进一步拮抗效果检测。

4 拮抗效果的测定

4．1 对峙培养法在加牛肉浸膏的 PDA平板中央接种待测细菌分离物，四周接种芒果炭疽

病菌（四点等距，距平板中央约 3cm），以只在平板四周接芒果炭疽病菌作为对照，每种处理 3

个重复。在25℃的生化培养箱内培养，逐日观察细菌与芒果炭疽病菌之间出现的抑菌带。连续

观察 7～10d。

4．2 菌丝体的形态学观察挑取对峙试验中芒果炭疽病菌菌落形态明显不规则（正常为圆

饼形）的菌落边缘菌丝，在显微镜下观察菌丝形态是否异常，与空白对照对比。

4．3 分生孢子萌发法挑选对峙试验中对芒果炭疽病菌菌落的生长有抑制作用的细菌，在

肉汁胨平板上培养 2d后， 每个皿中倒入 20mL无菌水刮洗菌落， 洗液用灭菌的细菌过滤器过滤，

取滤液并用灭菌的蒸馏水稀释10、25、50、100 和 200 倍，然后用稀释的滤液配置芒果炭疽病

24 菌的分生孢子悬浮液，以灭菌水配置的分生孢子悬浮液作对照。将分生孢子悬浮液点滴于干净

的载玻片上后， 移入 25℃恒温箱中培养， 从第 2h起， 每隔 2h在显微镜下观察孢子的萌发情况，

当对照的分生孢子大量萌发时，用计数器计数萌发的孢子数。整个试验设 3 次重复，每处理每

重复检查 100 个分生孢子（3个视野）。用下列公式计算萌发抑制率［10］。

孢子萌发率（％）＝［萌发孢子数／检查孢子数］×100

抑制孢子萌发率（％）＝100（％）－［处理组的萌发率／对照组的萌发率］×100