一、植物组织培养技术

实验 一 培养基母液的配制

一、 目的要求

掌握培养基母液的配制方法。

二、基本原理

配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将

所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系

列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培

养基为例，所需配制的母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS

铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长物质母液，在不同类型

的培养基中使用。

三、实验材料

电子分析天平、扭力天平、烧杯(50mL、100mL、500mL、1000mL)、量筒、

(1000mL、 100mL、 25mL)、 容量瓶(1000mL、 500mL、 100mL)， 磨口试剂瓶(500mL、

1000mL)、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉(1000W)、冰箱。 配制MS培养

基所需药品按培养基的配方准备。植物生长调节物质有2，4－D，NAA，6－BA

等。

四、操作步骤

1．MS大量元素母液的配制

按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。配

制时先用量筒量取蒸馏水大约800mL，放人1000mL的烧杯中，依次分别称取：

NH4NO3 33 g、KN03 38 g、KH2P04 3.4 g、MgS04¡7H2O 7.4 g、CaCl2¡2H20 8.8

g ，按顺序先后倒人烧杯中，用玻璃棒揽动，待第一种化合物溶解后再加入第二

种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒人 1 000mL 的容量瓶中，

用蒸馏水定容至1 000mL，然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制

日期、扩大倍数、配制人姓名，置于 4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升 MS

培养基吸取该母液量为50mL。

2．MS微量元素母液的配制

将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大 l 000倍，用分析天平

分别依次称取MnSO4¡4H20 22.3 g、ZnSO4¡7H20 8.6 g 、H3BO3 6.2 g、KI O.83

g、Na2Mo04¡2H2O O.25 g、CuSO4¡5H20 0.025 g、CoCl2¡6H20 0.025 g ，并用

蒸馏水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000mL的磨口试剂瓶中，

贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配

制MS培养基时，每配制1000mL培养基吸取此母液1mL。

3．铁盐母液的配制

在电子天平上准确称取 2.78g 硫酸亚铁(FeSO4¡7H2O)和 3.73g 乙二胺四乙酸钠

(Na2-EDTA)，分别倒人盛400mL蒸馏水烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶

解。将两种溶液倒人同一个 1 000mL 的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容

至1 000mL，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，

贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。如

果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中，则会容易形成沉淀。配制培养基时，每

配制1000mLMS培养基吸取此母液10mL。

4．MS有机母液的配制

用电子天平依次称取： 肌醇(环己六醇)5 000mg、 盐酸硫胺素(维生素B1)5mg、

烟酸25mg、甘氨酸100mg、盐酸吡哆醇(维生素B6)25mg，用蒸馏水依次溶解并

定容后，装入 500mL 的磨口试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、

配制人姓名，置于 4℃冰箱保存备用。配制培养基时，每配制 1000mL MS 培养

基吸取该母液10mL。

5．植物生长物质母液的配制

由于水剂型的植物生长物质在组织培养中既使用方便，又消毒简单，故在配

制培养基前常将常用的植物生长调节物质，如 2，4－D、6－BA和NAA等配制

成500mg¡L-1浓度的母液。其配制方法如下：

(1)2，4－D 母液：准确称量2，4－D 50mg，先用1-3ml90%酒精完全溶解后，

加蒸馏水定容；也可以加入少量碱(如1mol．L-1氢氧化钾、氢氧化钠)溶液，使

之中和成为钠盐或钾盐， 在水中溶解， 再加水定容至100mL， 即配成浓度为500mg

¡L-1的母液。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放在4℃冰箱保存。NAA

母液的配制过程与2，4－D相同。

(2)6－BA母液：准确称量 50mg6－BA，加入少量碱溶液(如 1mol．L-1 氢氧化

钾、氢氧化钠)或稀盐酸（1mol．L-1盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容

到100mL，即配成浓度为500mg¡L-1的6－BA母液。转入磨口试剂瓶中，并贴

上标签，注明母液名称、浓度和配制日期，放在4℃冰箱保存待用。

【注意事项】： 在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺

序，尽量把Ca2+、SO42-和PO43-离子错开分别溶解。同时稀释度要大一些，并

要慢慢地边混合边搅拌。

五、实验报告

总结培养基母液配制关键问题及其技巧

实验二 MS培养基的配制与灭菌

一、目的要求

学习用母液法配制MS培养基以及掌握培养基灭菌的方法及操作过程。

二、基本原理

组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质． 同时也是

各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。因此必须对培养基等进行灭菌处理，以确

保无菌操作的顺利进行。

三、实验材料

电子天平、 扭力天平、 烧杯(5OmL、 100mL、 500mL、 l 000mL)、 量筒(1000mL、

500mL、 25mL)、 药勺、 称量纸、 玻璃棒、 移液管(10mL、 5mL、 2mL、 1mL、 0.5mL、

O.2mL)、 电炉(1000W)、 石棉网、 洗耳球、 酸度计或pH试纸(5.0-7.0)、 三角瓶(50mL、

100mL)或果酱瓶、耐高温高压的专用封口膜、线绳、冰箱、手提式消毒灭菌锅，

蔗糖、琼脂、1mol¡L-1 HCl、1mol¡L-1NaOH，2，4－D母液及MS基本培养基

各母液(实验一制备)。

四、操作步骤

1．培养基的配制

每组配培养基500mL， 培养基组成为： MS+6－BA0.5 mg¡L-1十 NAA0.1 mg

¡L-1十30g¡L-1蔗糖十5g¡L-1琼脂(pH 5.8)。

(1)．首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，如量筒、

烧杯、移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置；准备好蒸馏水及做瓶盖用的专

用封口塑料薄膜或用于封口的棉塞、牛皮纸和包装线等。然后，根据所需配制的

培养基用量，计算需吸取各母液的数量(mL)。

(2)．取50mL的烧杯一只，用25mL量筒取大量元素母液25mL，然后，用各母

液专用移液管分别吸取微量元素母液0.5ml、有机母液5mL、铁盐母液5mL和及

相应量的6-BA和NAA，置于烧杯中备用(注意：各母液移液管不能混用)。

(3)．取 500mL 烧杯一只，先用量筒量取 500mL 蒸馏水倒入烧杯中，用记号笔

画好液位线，再将蒸馏水倒出一半。准确称取琼脂粉 2.5g 倒入烧杯中，再称蔗

糖15g备用。 将加入琼脂的烧杯置于电炉上或微波炉内煮沸， 待琼脂完全溶化后，

加入15g蔗糖，充分溶解后，将准备好的含大量元素、微量元素、铁盐、有机物

和激素的母液混合液倒人烧杯中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一

并倒人 500mL 烧杯中，加热至沸腾后，将烧杯端离火源，并加蒸馏水定容至设

定的液位线。

(4)． 用1mol¡L-1HCI或1mol¡L-1NaOH将培养基的pH值调至5.8－6.0，用酸、

碱调节 pH 值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用 pH 试纸或 pH 计测试培养基的

pH值。

(5)．将500mL培养基分装入若干只100mL大小的三角瓶中，每瓶约装30mL培

养基。分装培养基时，切勿将培养基倒在瓶口或瓶外壁上。堵养基分装完后，应

随即用专用的耐高温高压的封口塑料薄膜或铝箔封好瓶口，并贴上标签，用记号

笔注明培养基名称、配制者姓名和配制日期，待灭菌用。

2．培养基的灭菌

可用于培养基灭菌的器材有多种类型， 本实验学习用手提式消毒灭菌锅进行

灭菌。其操作步骤如下：

(1)．把分装好的培养基及其他需灭菌的各种用具(如用牛皮纸包扎好的剪刀、镊

子、解剖刀、培养皿)和蒸馏水等，放入消毒灭菌锅的消毒桶内，将外层锅内加

入适量的水，以水位与锅内三角搁架相平行为宜。注意加水量不可过少，以防灭

菌锅烧干而引起炸裂事故。然后盖上锅盖，并将盖上的排气软管插入消毒桶壁的

排气槽内后，上好螺丝，逐个拧紧后，接通电源加热。

(2)．当灭菌锅盖上的压力表指针移至0.05MPa时，打开放气阀门排除锅内冷空

气，待压力表指针回复到零位后，关闭放气阀门继续加热。当灭菌锅的压力表指

针移至 0.1MPa(121.5℃)时，通过调节放气阀，控制热源，使压力表保持在该压

力15-20min，即可达到灭菌目的。

(3)．灭菌所需时间到后，应先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降；待灭菌锅

压力表的压力降低至¡0¡时，才能打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭

菌的培养基。 (4)．刚灭过菌的培养基应在室温下放置2-3d后，观察有无菌类生

长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长污染，方可使用。

【注意事项】：

1．灭菌锅内冷空气必须排尽，否则，压力表指针虽达到了一定压力，但由于锅

内冷空气的存在并达不到对应的温度，从而影响灭菌效果。

2．在灭菌过程中，当压力达到时，要严格控制时间，时间太长会使培养基中的

一些化学物质遭到破坏，影响培养基的成分；而时间太短则达不到灭菌效果。

实验三 无菌材料的转接和培养

一、目的要求

通过实验，掌握无菌材料的转接和培养

二、基本原理

利用离体根的培养，可以研究根系的碳素和氮素代谢，无机营养的需要，维

生素的合成与作用，生长素和生物喊的合成与分泌，形成层细胞的分裂、分化与

伸长以及根与地上部的相关性等。 为植物器官、 组织和细胞培养提供了基础知识。

近年来，也进行了离体根结瘤试验，证明豆科植物的根在离体条件下，能被根瘤

菌引起结瘤，并能固定大气中的氮气。烟草离体根在含生长素和激动素的培养基

上分化出芽。 离体根具有合成生 物碱的能力， 因而有可能被利用来生产药材。目

前，已能进行离体根培养的植物有：紫花苜蓿，三叶草、红车轴草，曼陀罗、烟

草、番茄、樱桃番茄，马铃薯、黑麦、小麦、松、向日葵等。

三、实验材料

1．材料 番茄、苜蓿、玉米等种子。 2．试剂 酒精、漂白精液(3-7%)、双氧水

(3-10%)、氯化汞(0.1%)。 3．培养基 MS+1 mg¡L-1NAA+0.8%琼脂+3%蔗糖。

4．器材 漏斗、滤纸、酒精灯、棉花塞或牛皮纸、长剪刀，解剖刀，长镊子、接

种针(弯成钩形)、培养皿、接种室或超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、三角瓶、酸

度测定仪或pH试纸。

四、操作步骤

1．种子的选择：挑选无病斑、霉点，虫害的番茄，苜蓿、玉米的种子

2．种子灭菌：先用自来水洗净种子，将它们置于小烧杯内然后倒入7%的漂白精

清液(15片漂白精加100ml水，溶解后过滤)，浸没种子，用玻璃棒搅拌，使漂浮

的种子浸下，再静置15-30分钟即可。有些种子难以灭菌，可采用重复灭菌或抽

气灭菌方法。

3．播种：将经灭菌的种子，在无菌条件下，用无菌水洗涤 3 次，然后用镊子将

种子播于铺有湿滤纸的培养皿中，在恒温室中进行暗培养 2～7 天，即长出无菌

胚根。

4．接种：将剪刀或解剖刀先在酒精灯上烧一下，冷却后剪取 0.3～1cm 长的无

菌根尖，然后用灭菌的镊子将根尖接种于盛有40ml培养液的100ml灭菌的三角

瓶中，使根尖漂浮在液面上，并塞上棉花塞。接种完毕将培养物置 25℃恒温室

中暗培养。

5．继代培养：上述离体根培养 10-14 天后，便长出许多侧根，此时便可进行继

代培养，选取生长旺盛，根色鲜白的培养物作为再培养的材料．在无菌条件下剪

取侧根和主根的根尖(长0.3-10mm)， 用钩形接种针钩出根尖， 移入新鲜培养液中，

进行静置恒温暗培养。如此无限重复，可继代培养数年。

五、注童事项

1．通常以pH 4.8－5.2为最适合。当氮源以铵态氮作单一氮源或主要氮源时，

最适pH 以7.2为佳。

2．通常离体根是在暗中培养的，但光能促进小麦离体根对离子与糖的吸收，因

此，光有利于小麦离体根的生长。

3．番茄、苜蓿、红花槭的离体根不需添加生长素便能生长，加了反而抑制生长，

然而生长素能促进欧洲赤松、白羽扇豆、矮豌豆、玉米离体根的生长，黑麦、小

麦的生长必需要有生长素。

4．碳源通常以蔗糖为佳，禾本科植物可用葡萄糖为碳源。

5．维生素Bl是必需的。

实验四 外植体的消毒及其愈伤组织的诱导

一、目的要求

通过实验，初步掌握外植体植物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体

愈伤组织诱导的方法。

二、基本原理

植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织， 甚至单个

细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适

的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得

组织培养成功的最基本的前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在

合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞

团¡¡愈伤组织。而植物生长调节剂如 2，4－D 等是诱导外植体形成愈伤组织的

重要影响因素。

三、实验材料

1．材料 新鲜的胡萝卜块根。

2．试剂及培养基 1 g¡L-1HgCl2(剧毒!小心使用)、750mL/L -1 乙醇、无菌水。

3．胡萝卜块根愈伤组织诱导的培养基：MS+2，4-D 1mg/L-1+30g/L -1 蔗糖+8 g/L -1

琼脂(pH5．8) 。

4．器材 无菌吸水纸、一次性手套、脱脂棉花、标签纸、记号笔、超净工作台、

酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀等。

四、操作步骤

1．接种前，用 75%乙醇棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放人超

净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约 20-30min，然后开送风开关，

之后关闭紫外灯，通风10min后，再开日光灯即可进行外植体的消毒和接种等无

菌操作。

2．将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织、切成小块分别置

于100mL烧杯中， 用75%乙醇溶液浸泡30s后， 移人添加1-2滴吐温-20(Tween-20)

的 0.1%氯化汞溶液浸泡 10min，用无菌水洗涤 4 次，无菌纸吸干水分后，置于

经灭菌处理过的培养皿中。 使用镊子和解剖刀时， 应先在酒精灯火焰上炽烧片刻，

冷却后，修去外围组织，再将胡萝卜髓部组织切成 0.5cm3 的小块。以上操作都

要求在酒精灯火焰旁进行。

3．用无菌的镊子，将胡萝卜髓部组织小块接种至盛胡萝卜块根愈伤组织诱导培

养基的三角瓶中，每瓶接种3-4块，封口后，贴上标签，注明姓名、接种日期、

培养基名称和材料名称。

4．将上述接种有胡萝卜块根外植体的培养瓶置于光照培养箱中或组织培养室内

暗 培养，并整理、清洁超净工作台台面。 5．经常观察胡萝卜块根外植体的生

长变化或污染情况，并在培养¡段时间后（3 周左右）统计外植体的污染率以及

其愈伤组织的诱导率。

五、实验报告

1．观察胡萝卜块根切片外植体接种后 1-6d 左右的污染情况，并统计被污染的

块根外植体数，计算出污染率及确定合理的外植体灭菌时间。

污染率（%）= （污染材料数/接种总材料数）X100

如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有

污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间可能过长，组织被破坏死亡；接

种材料若没有出现污染，生长正常，则表明此时为该消毒剂的最适宜消毒时间。

2．观察并逐日记录胡萝卜切块产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前外植

体的形态变化，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征(包括愈伤组织的

颜色、质地和色泽等)；并计算外植体的愈伤组织诱导率。

诱导率（%）= （形成愈伤组织的材料数/接种总材料数）X100

六、思考题

1．为什么常在消毒溶液中加入 1-2 滴表面活性剂(如吐温)?为什么外植体用消毒

剂消毒后，再用无菌水洗涤干净? 2．在接种过程中，通过哪些措施来防止杂菌

对接种工具、接种材料的污染?

二、植物基因工程

实验一 植物基因组 DNA快速制备及其检测

一、 目的： 了解和掌握植物基因组DNA快速制备技术以及对DNA

的琼脂糖凝胶电泳检测技术。

二、 原理：新鲜植物材料在液氮下研磨或有缓冲液存在情况下研

磨，破碎细胞释放其基因组DNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化胺）是一种

去污剂，可溶解细胞摸，在高离子环境下和核酸形成复合物并可溶解，而样

品中蛋白和多糖（酸性粘多糖）则沉淀，由此将核酸和蛋白以及多糖分开。

分离得到核酸，再经过氯仿－异戊醇抽提进一步除去蛋白质，最后可以得到

较高质量的核酸。这种方法获得的DNA样品可用于基因的PCR扩增、分子

标记扩增以及分子杂交实验。

三、 材料试剂和仪器设备

1. 植物材料：新鲜植物材料（叶片、茎段等）

2. 化学试剂：２ＸCTAB提取缓冲液（100mM Tris-Cl, 1.4M NaCl, 20mM

EDTA, 2% CTAB）, 乙醇，氯仿，异戊醇，饱和酚，无菌双重蒸馏水。

氯仿/异戊醇配成24/1。

3. 仪器设备：台式离心机、恒温水浴、电泳设备，凝胶成像系统

四、 实验方法

1. 取新鲜叶片，清洗干净，用滤纸吸干水分

2. 用1.5ml带盖离心管取叶片（一个小圆片），在管内研磨破碎细胞

3. 加入600ul 2XCTAB提取缓冲液，涡旋混匀

4. 65℃水浴1小时，期间每隔20分钟反转摇匀一次

5. 加入等体积氯仿-异戊醇（或等体积酚仿异戊醇）颠倒混匀

6. 6500rpm离心30分钟，取上清液至新的离心管内

7. 可重复5，6步骤

8. 上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇沉淀 DNA（-20℃静置 20 分钟或更长

或过夜）

9. 12000rpm离心5分钟，去上请

10. 75%乙醇清洗DNA，2-3次

11. 风干后加入100ul无菌双重蒸馏水溶解DNA

12. 准备1%琼脂糖凝胶（30分钟凝胶固化）

13. DNA电泳（电压设置为５ｖ／ｃｍ，电泳４０～６０分钟）

14. 紫外检测

15. 记录

五、 结果分析：根据凝胶结果进行分析

六、 思考题

1. 植物基因组制备过程中应该特别注意什么？

2. DNA凝胶电泳原理

七、 参考书

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验二 PCR扩增制备目的基因

一、目的要求

1． 学会PCR仪的使用方法。2． 掌握目的基因的PCR扩增基本操作技术。3． 学

会PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测法。

二、基本原理

PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火

和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的目的靶

DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，

两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在

Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3¡端为合成的起点，以单核苷酸为原料，

沿模板以 5’→3’方向延伸，合成 DNA新链。这样，每一双链的 DNA模板，

经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如

此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循

环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍， PCR产物得以2n

的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，

实际上一般可达106～107倍。

三、实验材料

1．器材 PCR 仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外检测仪、超净工作台、台式离心

机、冰箱、灭菌锅、微量移液取样器、移液器吸头、0.2ml PCR微量管、双面微

量离心管架等。实验前把0.2ml PCR微量管装入铝制饭盒高温灭菌、移液器吸头

装入相应的吸头盒高温灭菌。2． 试剂 2U/ul Taq DNA聚合酶， 10XPCR缓冲液，

10mM dNTPs ， 引物 （ 上游 5-CAAGTCGAACGGTAGCAG-3 ； 下游

5-CTTCGTCACCCTCTGTATG-3）、模板 DNA（1200bp），无菌 dd H2O 、TBE

电泳缓冲液, Gold view核酸染料，加样缓冲液。

四、操作步骤

1．在0.2ml PCR 微量离心管中配制25ul反应体系

dd H2O 18.5ul

10XPCR 缓冲液 2.5ul

10mM dNTPs 0.5ul（每种dNTP终浓度0.2mM）

10¦M引物 各1ul

模板质粒 1ul

Taq酶 0.5ul（1U） 总体积 25ul 离心数

秒即可上机循环。

2． PCR反应程序： (1)． 94℃ 5min （预变性） (2)．94℃ 30s (3)．60

℃ 30s (4)． 72℃ 1min30s 35 个循环（②-④） (5)． 72℃ 10min 4

℃保存。

3．PCR结束后，取10¦l产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要

产物带。

五、思考题

1．复性温度如何确定？ 2．为什么要在最后延伸 10min？ 3．是否有非特异性

扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验三 从琼脂糖凝胶中回收目的 DNA片段

一、 目的要求

学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。

二、基本原理

PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，按分子量大小被分开，排列在凝胶

中，跟 DNAMarker 分子量的对比下，找到目的 DNA 带所在的凝胶，并把它切

下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀

或过柱即可获得目的DNA片段。

三、实验材料

1．器材 紫外检测仪、电子天平，恒温水浴锅，台式离心机，快速混匀器，冰箱，

灭菌锅、微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，

水漂，刀片，一次性手套等。实验前把1.5ml微量离心管装入铝制饭盒高温灭菌、

移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌。

2．试剂 DNA 分子量标准，DNA 快速纯化/回收试剂盒（100 次）（500bp 以上

片段，回收率90%以上），无水乙醇。

四、操作步骤

1．切胶 电泳结束后，把凝胶 EB 染色 10～20min，在紫外灯下找到目的 DNA

带，并用刀片切下胶中 DNA 产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至

一个称量过得1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

2．从凝胶中回收目的 DNA 片段（按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作）

(1)．鼎国DNA快速纯化/回收试剂盒（100次）组成成分： ①．离心柱 100个

柱上含有树脂 ②．溶液 A 100ml 6M NaClO4,0.03M NaAc，pH5.2,少量酚

红 ③．溶液 B 1.5ml 3M NaAc ④．溶液C 60ml 用时加入70ml无

水乙醇,充分混匀 ⑤．溶液D 6ml TE缓冲液

(2)步骤： ①．切取含DNA片段的琼脂糖（100mg～300mg）用吸头捣碎按重量

比1：3（切取重量：溶液A的体积比）加入溶液 A。 ②．65℃水溶5-10分钟，

胶完全溶化即可，其间可振荡助溶 2-3 次，待溶化后置室温加入 15ul 溶液 B,充

分混匀。注：如果体积大于500¦l,可适当增加溶胶时间。 ③．将溶液置于离心柱

中， 静置2分钟， ≥8000rpm 离心20-30秒， 若一次加不完， 可分两次离心。④． 倒

掉液体，加入500¦l溶液 C于离心柱中8000rpm离心 20-30秒，弃液体。 ⑤．重

复步骤4。⑥． 12000rpm再次离心1分钟， 甩干剩余液体以除去残余酒精。⑦． 将

离心柱置于新的离心管中， 室温敞开离心管盖放置5～10分钟， 使乙醇挥发殆尽。

⑧．加入20～30ul溶液D（50℃水浴），静置 2分钟。 ⑨．15000rpm离心1分

钟，管底溶液即为所需DNA。 将DNA贮存于-20℃可长期保存。

【注意事项】： 1．电泳缓冲液可为 TAE 或 TBE，但 TAE 效果最佳。 2．影响

回收率和回收质量最主要因素是 PH 值和切胶薄厚。 溶液 A 为橙黄色，有利于

观察琼脂糖是否完全溶解，也是 pH 指示剂。用户回收时当总体积大于 500ul可

适量多加溶液B；切胶越薄越好。 3．离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，

亦没有关系，可敞开盖离心。 4．水浴温度范围为 50～65℃亦可，溶液 D 的用

量视用户对DNA浓度要求而定。 5．收质量可用OD260/280比值来判断，本试

剂盒所得 DNA 比值大于 1.4，比值偏低主要是一些无机离子的存在，不影响其

他分子生物学操作，国内同类产品及一些低档进口产品 OD260/280 比值一般在

1.1～1.4 之间。

五、思考题

用EB染色和用紫外灯照射目的DNA会不会影响回收结果？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验四 随即扩增多态性 DNA （Random Amplified Polymorphism DNA， RAPD）

一、目的：了解和掌握RADP技术原理和方法

二、原理：RAPD 技术是建立在 PCR 基础上的一种可对整个未知序列的基因进

行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随

机多态核苷酸序列（通常为 10 个碱基对）为引物，在热稳定的 DNA 聚合

酶（Taq 酶）作用下，进行 PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或 PAGE 电泳检

测其扩增产物多态性。RAPD技术已经广泛的应用于生物品种鉴定，系谱分

析以及进化关系的研究。

三、 材料试剂以及设备

1. 植物材料：新鲜植物材料（用于DNA制备）

2. 试剂：PCR扩增试剂（Taq酶，缓冲液，dNTP）, 随机引物

3. 设备：PCR扩增仪，电泳设备，凝胶成像系统

四、 实验方法

1. 植物基因组DNA制备（可以利用上次制备的 DNA样品）2~3小时

2. RAPD扩增体系：10Xbuffer, 0.12mmol/L primer, o.12mmol/L dNTA, 2U

Taq enzyme, 20ng DNA，总体积为25ul。

3. PCR 扩增反应程序：95℃ 5’, 94℃ 45’’+ 36℃ 45’’+ 72℃

90’’(30 cycles), 72℃ 10’,TR保存。（2~3小时）

4. 电泳检测（1小时），可在下个实验进行。

五、实验结果分析： 根据电泳结果进行分析

六、思考题

1. 分子标记概念

2. PCR原理

3. 随机引物扩增原理

七、 参考文献

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验五 第 II类限制性内切酶及其使用

一、目的：了解和掌握第II类限制性内切酶及其使用方法

二、原理：第II类核酸限制性内切酶可以在DNA分子上特异识别并在识别位点

特异切割DNA分子。许多第II类限制性内切酶在酶量过大或切割反应时间过长

以及缓冲液不合适时会引起星点活性（star activity），使用时应特别注意。

三、材料试剂和设备

λ-DNA，Hind III, 缓冲液M，37℃恒温设备，电泳设备，灭菌的离心管等，冰

盒

四、实验方法

1. 酶切体系准备：ddH2O + 10Xbuffer+λ-DNA 1ug + HindIII 1U, 总体积为

50ul。混匀，离心。

2. 酶切反应条件：37℃ 2~3小时（或过夜）

3. 凝胶准备（可提前准备），30分钟固化

4. 电泳检测：1小时

5. 紫外检测，记录。

五、实验结果： 根据实验结果进行分析

六、 标准： λ-DNA-Hind III 标准酶切后可得到8条谱带： 23130bp, 9416bp, 6557bp,

4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp。

七 思考题

1. 限制性内切酶有几大类，特点是什么？

2. HindIII的缓冲液中不应该存在什么离子？

3. 使用限制性内切酶时应特别注意什么？

八、 参考文献

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验六 目的基因片段与载体连接

一、 目的要求

学会目的DNA片段与载体的体外连接技术。

二、基本原理

DNA连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA 片段仅靠在一起的3‵羟基末

段与5‵磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接，如果是两个或两个

以上不同的双链 DNA 片段连接，则产生重组 DNA 分子。在 Mg2+和 ATP 存在

下， T4DNA连接酶即可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接 （本实验），

也能催化双链DNA片段平末端之间的连接。 TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物都

带有一个3‵－A（目的DNA）与pUCm-T载体在T4DNA连接酶的作用下形成

一种新的重组分子。

三、实验材料

1．器材 超净工作台，台式离心机，恒温摇床，冰箱，微量移液取样器，移液器

吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架等。实验前把0.2ml 微量离心管装

入铝制饭盒高温灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌。

2．试剂 pUCm-T 载体，目的DNA片段，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液

等。

四、操作步骤

取一个灭菌的0.2ml微量管， 按下列次序加入(pUCm-T Vector 使用说明书操

作) l．1ulLigation Buffer (10X) 2．50ng (1.5ul) 的pUCm-T载体 3．6.5ul 纯化

的 PCR 产物(0.2pmol 的 PCR 产物, 通常状况没有必要对 PCR 产物进行定量)

4．1ul T4 DNA Ligase（4U/vl） 总体积10ul 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，

然后置于 16C 恒温培养箱中保温过夜。连接后的产物可以立即用来转化感受

态细胞或置4C 冰箱备用。

五、思考题

l．连接酶的最适温度是多少？ 2．为什么要采用16C 下连接。

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验七 细菌转化

一、目的要求

学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。

二、基本原理

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性

状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技

术。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于感受态细

胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基

上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得

到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

三、实验材料

1．器材 快速混匀器，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，台式离心机，超净工作

台，恒温培养箱，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量

离心管架，培养皿（90mm），酒精灯，玻璃涂棒，小镊子，无菌牙签，摇菌管等。

2．试剂 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），X-gal（5-溴-4-3 吲哚基β-D 半

乳糖苷）， 无菌dd water，胰化蛋白胨20g SOC培养基成分(1L) 酵母提取物

5g NaCl 0.5g 在 950ml 去

离子水中加入以上药品之后，摇动容器使溶液完全溶解。用5M NaOH 调pH值

至7.0。高温灭菌20min后冷至60℃或60℃以下，加入20ml除菌的1M 葡萄糖

溶液（90ml水＋18g葡萄糖，完全溶解后定容至100ml，用0.22¦m滤器过滤除菌

四、操作步骤

1．事先将恒温水浴的温度调到42℃。 2

2．转化 (1)．新鲜制备的或-70℃下保存的 100ml 感受态细胞，置于冰上，完全

解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。 (2)．加入 2ml 连接液，轻轻混匀。 (3)．冰上

放置30分钟。 (4)．42℃水浴热激60秒。 (5)．冰上放置2分钟。 (6)．加400ml

SOC 培养基，37℃ 200-250rpm振荡培养 1 小时。 (7)．室温下 4000rpm离心 5

分钟，用枪头吸掉400 ml上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。

五、思考题

影响转化效率的因素有哪些？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验八 重组子的筛选

一、目的要求

学会篮白斑筛选法筛选重组子的技术。

二、基本原理

具有完整乳糖操纵子的大肠杆菌体能转译β－半乳糖苷酶（Z）、透过酶（Y）

和乙酰基转移酶（A），当培养基中存在诱导物 IPTG和X-gal时，可产生蓝色沉

淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入β－半乳糖苷酶基因（LacZ）

部分缺失的片段（LacZ‵），则重组DNA分子转化LacZ‵互补型菌株，会在含

有IPTG和X-gal的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而LacZ‵互补型菌株，

由于不能转译出有功能的β－半乳糖苷酶，在含有 IPTG 和 X-gal的培养基中得

到的转化子是白色菌落。因此，可以根据菌落篮白颜色的不同，筛选出真正需要

的转化子。即很多载体都携带一段细菌的 lacZ 基因，它编码β－半乳糖苷酶 N-

端的 146 个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的 C-端肽链。当载体

与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的

底物X-gal 变为篮色化合物，这就是所谓的α－互补。而重组子由于基因插入使

α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细

菌为无色菌落或噬菌斑。

三、实验材料

1．器材 恒温摇床，超净工作台，恒温培养箱，灭菌锅，微量移液取样器，移

液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，酒精灯，小镊子，无菌牙签，

摇菌管等。 2．试剂 LB培养基（加氨苄青霉素），无菌dd water， 氨

苄青霉素储存液：无菌水配制5mg/ml，分装后-20C 保存。

四、操作步骤

1．将细菌（从实验七得到）涂布在90mm LB 平板中，平板在使用前预先用20ml

100mM IPTG和100ml 20mg/ml X-gal 涂布。 注：细菌的用量依连接的效率及感

受态细胞的感受率而进行适当的调整。

2．平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

3．观察转化产物的涂布平板和培养后的结果。

4．配制LB（含50g/mL 氨苄青霉素）的培养基及高温灭菌。

5．在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50g/mL 氨苄青霉

素），用记号笔写好编号。

6．在超净工作台中将 70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙

签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛

有 3mL LB（含 50g/mL 氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取 3 个白色菌

落，分别装入3个摇菌管中。

7．37℃摇菌过夜。

五、思考题

1．如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释

这种现象？ 2．白色菌落出现的原理是什么？

六、参考书

a) ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

b) 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

c) J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992

实验九 转基因植物外源基因 PCR检测方法（特异扩增 PCR）

一、目的：学习和掌握转基因植物外源基因的PCR检测方法。

二、原理：利用PCR原理，通过转基因植物中外源基因序列设计一对特异引物，

以转基因植物基因组DNA为模板，扩增外源基因片段，检测外源DNA。

三、材料方法设备

植物材料：转基因７４１杨，内含有Ｃｒｙ１ＡＣ基因（使用的载体为pBtiA）

试剂： ２ＸCTAB提取缓冲液， 电泳缓冲液， PCR扩增试剂， 特异引物 （Ｐ１ ａ

ｎｄ Ｐ２）

设备：PCR扩增仪，电泳仪，恒温水浴，台式告诉离心机，凝胶成像系统

四、实验方法

1. 转基因741杨基因组 DNA制备 （参考实验一， 但65℃水浴20分钟）（1~2

小时）

2. 1%琼脂糖凝胶电泳检测（20分钟）

3. PCR特异扩增外源基因反应体系25ul: 10Xbuffer, 0.12mmol/L primer1 and

primer2, o.12mmol/L dNTA, 2U Taq enzyme, 20ng DNA

4. PCR反应程序： 95℃ 5’, 94℃ 45’’+ 55℃ 40’’+ 72℃ 50’’(35

cycles), 72℃ 10’,TR保存。（2~3小时）

5. 1%琼脂糖凝胶电泳检测（1小时）

五、实验结果：根据凝胶结果进行分析

六、思考题

1. 植物基因转化的方法有哪些？

2. 随机扩增和特异扩增PCR有什么不同？

七、参考文献

1. ＬＧ戴维斯等著，张钰等翻译，分子生物学基本实验方法。上海，复旦

大学出版社，1989。

2. 吴乃虎，基因工程原理。北京，科学出版社，2002

3. J 萨姆布鲁克等著，金冬雁等翻译，分子克隆。北京，科学出版社，1992